艾椒散質量標準研究

王越欣，李媛媛，王 梅，張文智，馮 敏，冀來喜，倪 艷

（1.山西省中醫藥研究院，山西 太原 030012；2.山西中醫藥大學，山西 晉中 030619）

艾椒散來源于治療銀屑病的臨床經驗方，已申請并授權發明專利（201610555543.9），由蜂房、苦參、川椒、土大黃、大楓子、蘆薈、艾葉等7味藥材組成，具有清熱燥濕、殺蟲止癢、活血化瘀之功效，療效顯著，價格低廉，且無副作用［1］。方中蜂房祛風止痛，殺蟲止癢，祛腐生肌，消炎止痛［2］，為君藥；苦參、川椒、土大黃三藥共為臣藥，清熱燥濕止癢，與君藥配伍，能夠加強祛風止癢之功效；大楓子、蘆薈二者共為佐藥，既能加強祛風止癢之功，又能起到燥濕清熱之效；艾葉祛濕止癢，活血化瘀，散寒止痛［3］，作為使藥，起調和諸藥之用。目前尚無對艾椒散質量評價的相關研究，為了控制其質量，保證臨床使用療效，本研究參照處方的功能主治，對方中主要藥味蜂房、艾葉和蘆薈進行了定性鑒別，選擇同時檢測大黃素、大黃酚作為土大黃的質量控制方法［4］，為艾椒散制訂了準確可靠的質量標準。本研究建立的方法具有較強的專屬性和準確性，能有效控制艾椒散的質量，值得推廣應用。

1 實驗材料

1.1 儀 器

Agilent 1100 series HPLC色譜儀（Agilent安捷倫化學工作站）、LC-300B型數控超聲波清洗機（山東濟寧魯超超聲設備有限公司）、DFY-200型200 g萬能粉碎機（西安比朗生物科技有限公司）、RE5298A旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、ZF1-Ⅰ多功能紫外分析儀（上海佳鵬科技有限公司）、YOKO-XR顯色加熱器（武漢科技新技術開發公司）、電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）、電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

蜂房、苦參、川椒、土大黃、大楓子、蘆薈、艾葉（生產企業均為安國市祁澳中藥飲片有限公司）；大黃酚（批號0796-200208）、大黃素（批號110756-201512）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，購自西隴科學股份有限公司；聚酰胺（100-200目）、硅膠G，水為超純水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品制備

按處方比例［1］稱取藥材后將其粉碎，70%乙醇浸泡過夜，用70%乙醇以合適的流速進行滲漉，收集滲漉液（終點為滲漉液變澄清）。將滲漉液減壓濃縮后移入蒸發皿中，于水浴鍋上蒸干并放入烘箱中烘干，將其研磨作為樣品粉末。

2.2 蜂房的TLC定性鑒別

2.2.1 供試品溶液制備 取本品粉末1 g，加入70%乙醇15 mL，超聲處理30 min，濾過，蒸干，加入1 mL甲醇溶解。將溶液加在聚酰胺柱（100～200目，1 g，內徑為1 cm）上，用甲苯20 mL與70%乙醇10 mL依次洗脫，收集70%乙醇洗脫液，蒸干，殘渣用0.5 mL甲醇溶解，即得。

2.2.2 對照藥材溶液制備 取蜂房對照藥材1 g，按“2.2.1”項下方法操作，即得。

2.2.3 陰性對照溶液制備 按2.1項下方法制備蜂房陰性樣品，取1 g，按“2.2.1”項下方法操作，即得。

2.2.4 鑒別 照薄層色譜（通則0502）試驗［5］，分別吸取上述3種溶液10μL、15μL、10μL，點于同一硅膠G薄層板，以乙酸乙酯-甲醇-水（8∶1∶1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以5%AlCl3乙醇溶液，置于氨蒸氣中熏后，在紫外光365 nm下檢視，供試品在與蜂房對照藥材色譜相應位置上顯相同的藍色熒光斑點且陰性對照無干擾（見圖1）。

圖1 蜂房的TLC圖

2.3 艾葉的TLC定性鑒別

2.3.1 供試品溶液制備取本品粉末2 g，加入石油醚（60～90℃）25 mL，置水浴上加熱回流30min濾過，濾液揮干，殘渣加正己烷1 mL使溶解即得。

2.3.2 對照藥材溶液制備 取艾葉對照藥材2 g，按“2.3.1”項 下方法操作，即得。

2.3.3 陰性對照溶液制備 按2.1項下方法制備艾葉陰性樣品，取2 g，按“2.3.1”項下方法操作，即得。

2.3.4 鑒別 照薄層色譜（通則0502）試驗［5］，分別吸取上述3種溶液10μL、5μL、10μL，點于同一硅膠G薄層板，以石油醚（60～90℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）為展開劑，展開，取出晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃下加熱至斑點顏色清晰。艾葉的供試品色譜中，在與艾葉對照藥材色譜相應位置上顯相同的紫色斑點且陰性對照無干擾（見圖2）。

圖2 艾葉的TLC圖

2.4 蘆薈的TLC定性鑒別

2.4.1 供試品溶液制備 取本品粉末1 g，加入70%乙醇15 mL，超聲30 min，過濾，蒸干，加1 mL甲醇溶解，即得。

2.4.2 對照藥材溶液制備 取蘆薈藥材0.5 g，按“2.4.1”項下方法操作，即得。

2.4.3 陰性對照溶液制備 按2.1項下方法制備蘆薈陰性樣品，取1 g，按“2.4.1”項下方法操作，即得。

2.4.4 鑒別 照薄層色譜（通則0502）試驗［5］，分別吸取上述3種溶液10μL、5μL、10μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水為（8∶1∶1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以5%AlCl3乙醇溶液，于紫外光（365nm）下檢視。蘆薈的供試品色譜中，在與蘆薈對照藥材色譜相應位置上顯相同的黃色斑點且陰性對照無干擾（見圖3）。

圖3 艾葉的TLC圖

2.5 土大黃HPLC含量測定

2.5.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Waters X-bridge C18（4.6×250 mm，5μm），流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25），檢測波長：254 nm，柱溫：25℃。理論塔板數按大黃素峰計算，應不低于4000。

2.5.2 對照品溶液的制備 取大黃素對照品、大黃酚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制備成每1 mL中含有大黃酚37μg、大黃素38μg的溶液，搖勻，0.45μm微孔過濾，即得。

2.5.3 供試品溶液的制備 取艾椒散樣品0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲30 min，放冷，再稱定重量。用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液5 mL，置于燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min。再加二氯甲烷10 mL，超聲30 min，放冷，置于分液漏斗中，用少量二氯甲烷洗滌容器，洗滌液并入分液漏斗中，分取二氯甲烷液。酸液再用二氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并二氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇適量使溶解，轉移至10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液經0.45μm微孔過濾，即得。

2.5.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.5.2”項下的對照品2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、20μL、40μL注入高效液相色譜儀。以測得的峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

表1 線性關系考察結果 （n=6）

2.5.5 精密度試驗 精密吸取“2.5.3”項下艾椒散供試品溶液10μL，按“2.5.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄大黃素、大黃酚的峰面積，計算其RSD分別為1.6%、0.5%。表明儀器具有良好的精密度。

2.5.6 穩定性試驗 精密吸取“2.5.3”項下艾椒散供試品溶液10μL，分別于樣品制備后的0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按“2.5.1”項下色譜條件進樣，測定峰面積，計算大黃素、大黃酚含量的RSD分別為1.69%、0.47%。表明供試品溶液在制備后24 h內穩定性良好。

2.5.7 重復性試驗 按“2.5.3”項下的方法制備6份艾椒散供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定。結果測得6份供試品中大黃素、大黃酚含量的RSD分別為4.23%、3.52%。表明該方法具有良好的重復性。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取艾椒散樣品9份，每份0.4 g，分別準確加入大黃素對照品溶液（38μg/mL）11.00 mL、13.76 mL、16.51 mL，大黃酚對照品溶液（37μg/mL）15.77 mL、19.71 mL、23.65 mL，按“2.5.3”項下的方法制備加樣回收供試品溶液，精密吸取10μl，按“2.5.1”項下色譜條件進樣測定，計算各待測成分的加樣回收率。結果見表2。

表2 加樣回收率測試結果 （n=6）

2.5.9 樣品測定 精密吸取3份供試品溶液各10μL，平行進樣2針，兩份對照品溶液各10μL分別注入高效液相色譜儀測定，即得色譜圖（見圖4），結果顯示，峰形理想，基線平穩，大黃素與大黃酚分離效果較好，且陰性對照無干擾。以外標法計算艾椒散中大黃素與大黃酚的含量。結果見表3。

圖4 土大黃HPLC含量測定圖

表3 樣品含量測定結果

由表3可知，3份樣品大黃素、大黃酚的平均含量分別為1.3075 mg/g、1.8225 mg/g?？紤]到藥材來源差異，本研究以略低于含量最低值設限，初步擬定艾椒散中大黃素的含量不得少于1.20 mg/g、大黃酚的含量不得少于1.80 mg/g。

3 討論

蜂房的薄層鑒別照參考文獻［2］實驗中供試品和對照藥材直接使用濾液，斑點不明顯，且供試品圖譜背景色較深，因此采用聚酰胺柱對其進行純化。采用聚酰胺純化供試品溶液時，考察了用甲苯、70%乙醇，水、70%乙醇依次洗脫，薄層鑒別結果顯示采用甲苯、70%乙醇洗脫后斑點清晰而且分離效果較好，供試品色譜在與對照藥材色譜相應位置上顯相同的藍色熒光斑點且陰性對照無干擾，故采用此方法作為蜂房的薄層鑒別方法。

實驗考察了蘆薈樣品的展開劑，分別比較了乙酸乙酯-甲醇-水兩種不同配比的展開效果（100∶17∶13、8∶1∶1），結果發現以8∶1∶1比例展開，以5%AlCl3乙醇溶液為顯色劑時，色譜圖上斑點清晰而且分離效果較好，故采用此方法作為蘆薈的薄層鑒別方法。

土大黃具有清熱解毒、殺蟲止血、祛瘀通便等功效［6］，其中大黃素和大黃酚為其中主要藥效成分，大黃素具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗真菌、抗原蟲等作用［7］，大黃酚具有抗菌等作用［8］。大黃素、大黃酚均以游離蒽醌和結合蒽醌的形式存在，本研究采用稀鹽酸水解可將結合蒽醌全部水解成為游離蒽醌，便于含量測定。游離蒽醌溶于二氯甲烷等有機溶劑，不溶于水，在水解的同時加入二氯甲烷可使水解出的游離蒽醌溶于二氯甲烷，有利于萃?。?］。流動相比例的選擇方面，實驗前期考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸等不同流動相，結合峰形、基線和分離度等因素調整流動相比例，最終選定甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）作為流動相，峰形理想，基線平穩，大黃素與大黃酚分離效果較好，且陰性對照無干擾。