復方透骨草酊對睪酮的抑制及促進毛發生長作用的初步研究

孔維嘉，陳佳祺，張文旭，商 鈺，薛雨辛，朱慶文

雄激素性脫發（androgenetic alopecia，AGA）是一種與遺傳因素及雄激素依賴相關的常見毛發疾病，屬于中醫學 “發蛀脫發”“蛀發癬”等范疇。中國雄激素性禿發診療指南顯示，該疾病在我國男性的患病率約為21.3%，女性患病率約為6.0%[1]。AGA多見于青春期后男性，以進行性毛發減少、毛囊的微小化為主要表現，伴皮脂溢出及輕微瘙癢。此疾病嚴重影響美觀，為早發性AGA患者帶來身心雙重負擔[2-4]。

目前美國食品藥品監督管理局（FDA）僅批準米諾地爾和非那雄胺作為治療藥品，但使用米諾地爾會出現面部多毛癥等不良反應，而非那雄胺則會導致性功能障礙等不良反應[4,5]。研究表明[6,7]，中醫對本病有獨特的治療優勢。復方透骨草酊由燕京皮膚科專家趙炳南教授經驗方透骨草方化裁而來，全方由透骨草（impatiens balsamina）、側柏葉（platycladi cacumen）、皂角（fructus gleditsia ）、白礬組成，具有祛濕解毒止癢的功效，文獻表明原方療效顯著[8,9]。臨床研究發現AGA與睪酮及雙氫睪酮等雄激素含量密切相關[10]。因此本文用復方透骨草酊處理以睪酮誘導的 C57BL/6 病理脫發小鼠模型，通過測定小鼠毛發生長情況、毛囊細胞凋亡及血清睪酮、雙氫睪酮水平等，探究復方透骨草酊促進毛發生長的作用，并為其治療AGA提供初步實驗證據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性C57BL/6 小鼠，6周齡（體重 18～20 g），SPF級，40只[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001]。實驗前，穩定飼養1周；飼養環境：濕度 50%～70%，溫度 25 ℃～27 ℃（室溫），自然光照。

1.1.2 藥物與試劑 復方透骨草酊由透骨草40 g、側柏葉40 g、皂角15 g、白礬5 g組成（購自北京康泰民生藥房）。上述藥材碾碎，加入200 ml 75%乙醇，浸泡7晝夜，后采用摻漉法到400 ml，過濾去渣，裝瓶備用。睪酮（北京伊諾凱科技有限公司），75%乙醇（杭州歐拓普生物技術有限公司），10%中性緩沖甲醛固定液（浙金械備20170017號），2%米諾地爾搽劑（國藥準字H20052642），PH0429抗熒光淬滅封片劑，PH0615蛋白酶K溶液。小鼠睪酮（T）、雙氫睪酮（DHT）、小鼠雌二醇（E2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（江蘇科特生物科技有限公司），原位雜交技術原位末端標記法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒（生工生物工程股份有限公司）。

1.1.3 儀器及設備 伯樂iMark酶標儀（美國Bio-Rad），BSA224S-CW 分 析 天 平（ 德 國 Sartorius），5424R高速離心機（德國Eppendorf），KS 4000 i control 控溫搖床（德國IKA），DMI6000 B倒置熒光顯微鏡、TP1020自動組織脫水機、RM2235切片機、EG1160組織包埋機（德國Leica），CS-VI攤片烤片機、冷凍臺（孝感市宏業醫用儀器有限公司），移液槍（德國 Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及涂藥方法 將40只雄性 C57BL /6小鼠，6周齡，正常喂養1周后，用Excel軟件隨機分為4組：空白對照組、脫發模型組、米諾地爾酊組、復方透骨草酊組，每組10只小鼠。電動剃須刀物理背部脫毛面積2 cm×3 cm，創傷刺激誘導小鼠毛囊從休止期進入生長期。脫毛后小鼠皮膚呈粉紅色，無其他不良反應。脫毛第2天按照對應方法對各組小鼠背部脫毛區域用棉簽均勻給藥，每天1次。文獻[11]顯示，脫毛20 d以后小鼠毛囊從新進入休止期，故本實驗連續19 d給藥。參照文獻[12, 13]建立睪酮誘導的病理脫發模型，涂樣方法見表1。

1.2.2 觀察毛發生長情況 每天觀察小鼠皮膚顏色變化，記錄小鼠背部實驗區皮膚從開始給藥到變黑、從開始變黑到毛發長出表皮的時間。以皮膚顏色從粉紅色（休止期）到開始變黑（生長期）作為毛發從休止期到生長期的時間；皮膚開始變黑（生長期）到毛發長出皮膚表面的時間作為毛發從進入生長期到長出皮表的時間[14]。

1.2.3 血清中激素含量的測定 脫毛后第19 d，每組小鼠進行眼球采血，1 500 r/min離心10 min后分離血清，用ELISA試劑盒測定每組小鼠血清中T、DHT以及E2含量，記錄并求其平均值。

1.2.4 TUNEL毛囊細胞凋亡檢驗[15]脫毛后第19 d取血后，將每組小鼠頸椎脫臼法處死，在脫毛部位平行于脊椎處取材，剪去新長出的毛發，后將皮膚修剪成1 cm寬的長條狀。置于10%甲醛中浸泡2 d后，用自來水沖去甲醛，自動脫水機脫水，石蠟包埋，修塊，切片，使切片方向與毛發生長方向一致，切片厚度為4.5 μm。用TUNEL檢測毛囊內細胞的凋亡狀況，嚴格按照紅色熒光TUNEL試劑盒說明書操作，具體方法：①二甲苯脫蠟5～10 min 2次；②滴加 20 μg/ml 蛋白酶 K，無水乙醇，95%乙醇，80%乙醇，蒸餾水分別處理2 min；③PBS 洗滌玻片去除蛋白酶K；④根據檢測樣品數目和表2配制反應混合液；⑤滴加反應混合液50 μl，37℃避光孵育 60 min；⑥吸去反應混合物，PBS 洗板3～5次；⑦用1×Hoechst 33342染色細胞核；⑧用抗熒光淬滅封片劑封片后熒光顯微鏡觀察并拍照。利用Image Por-plus6.0 圖像分析軟件，計數紅色熒光細胞和區域內總細胞核數量，計算紅色熒光細胞所占百分比，即凋亡指數（apoptotic index，AI）。

表2 TUNEL毛囊細胞凋亡檢驗

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS26.0對實驗數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，若有統計學意義，用SNK 法進行兩組間檢驗。如果數據不是正態分布的，則使用非參數Mann-Whitney秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對C57BL/6 小鼠毛發生長周期的影響

涂藥5～7 d后，米諾地爾酊組和復方透骨草酊組小鼠皮膚開始變黑，6～8 d后空白對照組開始變黑，脫發模型組開始變黑時間為7～10 d。米諾地爾酊組和復方透骨草酊組小鼠毛囊從生長期到毛發長出皮表時間為2～4 d，空白對照組及脫發模型組為3～5 d。脫發模型組較空白對照組小鼠毛囊從休止期進入生長期、從生長期到長出表皮時間明顯延長（P＜0.05）。統計結果表明，涂抹睪酮對C57BL/6 小鼠的毛發生長具有抑制作用；復方透骨草酊組及米諾地爾酊組小鼠毛囊從休止期進入生長期、從生長期到長出表皮時間較空白對照組明顯縮短（P＜0.05），較脫發模型組時間顯著縮短（P＜0.01），提示可從一定程度上緩解睪酮對小鼠毛發生長的抑制作用。各組藥物對C57BL/6 小鼠背部毛發生長的影響見表3。涂藥第19 d后，脫發模型組毛發再生呈抑制狀態，復方透骨草酊組及米諾地爾酊組小鼠恢復毛發再生能力（圖1）。

表3 藥物對AGA小鼠毛發生長周期的影響（±s，n = 10）

表3 藥物對AGA小鼠毛發生長周期的影響（±s，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組 別 從休止期到生長期時間（d）從生長期到長出皮表時間（d）空白對照組 7.10±0.88 3.70±0.68脫發模型組 8.30±0.95## 4.50±0.71#米諾地爾酊組 6.20±0.63#** 2.90±0.74#**復方透骨草酊組 6.10±0.74##** 2.80±0.92#**

圖1 各組小鼠第19 d背部毛發生長情況

2.1 對C57BL/6 小鼠血清中激素水平的影響

與空白對照組相比，脫發模型組小鼠血清中T含量顯著升高（P＜0.01），DHT含量明顯升高（P＜0.05），E2含量無顯著差異（P＞0.05）。與脫發模型組相比復方透骨草酊組的T、DHT含量顯著降低（P＜0.01），E2含量沒有顯著性差異；米諾地爾酊組T含量顯著降低（P＜0.01），DHT含量明顯降低（P＜0.05），E2無顯著差異（表4）。實驗結果表明，涂抹睪酮可誘導小鼠血清中T、DHT含量升高，復方透骨草酊與米諾地爾酊可逆轉睪酮引起的小鼠高雄激素水平，對雌二醇無明顯作用。

表4 藥物對 C57BL/6 小鼠血清中激素含量的影響（±s，n = 10）

表4 藥物對 C57BL/6 小鼠血清中激素含量的影響（±s，n = 10）

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組 別 血清睪酮（T）（nmol/L）血清雙氫睪酮（DHT）（nmol/L）血清雌二醇（E2）（pmol/L）空白對照組 288.97±39.38 38.25±5.78 200.54±33.50脫發模型組 355.97±47.72## 48.37±8.09# 216.46±33.60米諾地爾酊組 272.26±52.79** 42.61±8.33* 207.39±36.75復方透骨草酊組 249.84±43.53** 37.94±5.73** 206.77±29.32

1.3 對C57BL/6 小鼠毛囊細胞凋亡的影響

TUNEL細胞凋亡試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況，圖2中紅色熒光代表凋亡細胞，同時對組織切片進行Hoechst細胞核染色，藍色熒光代表小鼠毛囊細胞核。脫毛后第19天，與不加反應混合液的陰性組相比，4組切片中均顯示熒光染色，表明該實驗結果有效。與空白對照組比較，脫發模型組紅色熒光明顯增強，且區域變大，細胞凋亡指數顯著升高（P＜0.01），表明造模成功；復方透骨草酊組及米諾地爾酊組圖像和凋亡指數均差異無統計學意義（P＞0.05）。與脫發模型組相比，復方透骨草酊組及米諾地爾酊組中紅色熒光均顯著減弱，區域減小，呈星點分散分布，細胞凋亡指數顯著降低（P＜0.01），提示復方透骨草酊及米諾地爾酊對C57BL/6小鼠毛囊細胞凋亡均有相似的明顯抑制作用（圖2，表5）。

圖2 藥物對C57BL/6 小鼠毛囊細胞凋亡的影響（×200）

表5 藥物對C57BL/6 小鼠毛囊細胞凋亡率的影響（±s，n = 10）

表5 藥物對C57BL/6 小鼠毛囊細胞凋亡率的影響（±s，n = 10）

注：與空白組比較，## P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組 別 凋亡指數（AI%）空白對照組 29.54±2.86脫發模型組組 51.44±2.16##米諾地爾酊組 16.09±1.60**復方透骨草酊組 17.34±2.20**

3 討論

正常毛發的生長周期包括生長期、退行期和休止期。T是引起脫發的一種重要雄性激素，在脫發區毛囊內可被Ⅱ型5α-還原酶還原成活性更強的DHT，兩者與雄激素受體蛋白結合，進入細胞核使ATP生成受阻，影響細胞能量代謝，毛母細胞角質化成為休止期毛發[10]。破壞毛發正常生長周期，處于退行期及休止期毛囊的比例上升，從而誘發AGA[16]。

復方透骨草酊由燕京皮膚科專家趙炳南教授經驗方透骨草方化裁而來，原方由透骨草四兩、側柏葉四兩、皂角二兩、白礬三錢組成，具有祛濕止癢，解毒消腫的功效。文獻顯示，原方對AGA等脫發疾病療效顯著，方中透骨草為君藥，散風濕、活血止痛，民間有單味透骨草煎湯外洗治療脫發的經驗[17]；同時鳳仙透骨草地上部分化合物具有抗菌、止癢及5α-還原酶抑制作用[18]；側柏葉為臣藥，助君藥涼血祛濕，對球菌、桿菌等有抑制作用[19]。研究表明總黃酮成分能夠促進血液循環，同時激活毛母細胞，從而發揮養發生發的作用[20]。鐘玲玲等[21]的復方側柏葉溶液治療AGA臨床試驗，總有效率為90.00%；佐藥皂角、白礬，解毒殺蟲止癢，對真菌、細菌有抑制作用。本實驗在“趙氏皮科酊劑制劑經驗”的基礎上將水煎劑改為酊劑，能夠增強清熱止癢、解毒殺蟲、活血散瘀的作用，改進后的復方透骨草酊更貼合臨床實際。

C57BL/6 小鼠是國內外目前廣泛應用的毛發周期動物模型[10,22]。6～8周飼養良好狀態下所有毛囊均處于休止期，物理拔毛后同步進入生長期，可通過觀察皮膚顏色變化來判斷毛發周期。本實驗通過每天在小鼠背部涂抹0.1%T溶液建立病理脫發模型[13]，選用復方透骨草酊作為實驗組，選用FDA批準治療AGA的惟一外用藥米諾地爾作為西藥對照。研究結果顯示，T通過延長C57BL/6小鼠毛囊從休止期進入生長期、從生長期到長出表皮時間，從而抑制毛發生長，而復方透骨草酊及米諾地爾酊可通過縮短時間從而促進小鼠毛發的生長。除此之外，筆者比較了小鼠血清中雄激素的含量，復方透骨草酊與米諾地爾酊可降低睪酮刺激引起的T及DHT含量增加，表明復方透骨草酊可能通過降低雄激素水平從而治療AGA。盡管有文獻顯示E2會通過改變雄激素代謝影響毛囊生長[23]，然而本實驗并未觀察到各組之間E2含量存在明顯差異，雌激素對毛發生長的影響需要進一步研究。

細胞凋亡是近年來研究毛發生長及周期的熱點，毛囊從生長期到休止期是以部分細胞凋亡為特征的程序性器官退化的過程。有研究表明，雄激素誘導轉化生長因子-β1表達增加，抑制毛囊細胞生長，促進凋亡[24]。TUNEL細胞凋亡檢測，經Hoechst染色后的正常細胞核呈靛藍色，而凋亡細胞核則呈致密濃染[25-27]，同時顯紅色熒光。本實驗結果顯示，復方透骨草酊組與米諾地爾酊組紅色熒光減弱、區域減少，且呈藍色致密濃染的細胞核也減少，凋亡率比脫發模型組顯著降低，驗證復方透骨草酊及米諾地爾酊通過抑制C57BL/6小鼠毛囊細胞凋亡，從而減少進入退行期及休止期毛囊的比例，延長毛囊生長期，具有防脫發作用。

綜上所述，復方透骨草酊能夠促進C57BL/6病理脫發小鼠的毛發生長，其作用機制可能與降低血清中T及DHT水平，抑制毛囊細胞凋亡相關。中醫藥外用治療皮膚疾病具有整體調節的優勢，關于復方透骨草酊對AGA患者自覺癥狀改善情況（如瘙癢、油膩感等）及用藥安全值得今后進一步研究。