582例高危妊娠產前羊水染色體微陣列檢測的臨床應用分析

張勝利 齊波 楊慶慧 陶華娟*

(1. 濰坊市婦幼保健院， 山東 濰坊 261011； 2. 浙江博圣生物技術股份有限公司， 浙江杭州 310007)

染色體是支配人類正常生長發育的遺傳物質，若發生變異則會導致人類機體功能異常，且不易治愈，對患兒及家庭帶來沉重的負擔，因此，通過產前診斷排查胎兒的健康狀況是最有效的防治策略。胎兒染色體異常的診斷方法包括核型分析、染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，FISH)等，其中核型分析是染色體疾病診斷的金標準，但傳統的核型分析無法檢出<10 Mb的染色體結構異常[1]。伴隨著人類基因組計劃的完成及近年來分子遺傳學方向的迅速發展， CMA在臨床上的應用得到快速的發展，已被推薦為兒童不明原因的發育遲緩及產前超聲異常的胎兒遺傳學檢測的首選診斷方法[2-4]，可用于檢測人類染色體微重復或微缺失引起的各種疾病，填補染色體核型分析不能檢測微缺失和微重復的不足[5]。臨床上應用比較廣泛的CMA技術平臺包括單核苷酸多態性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP array)和微陣列比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)[6]，相較于傳統的核型分析方法，它具有自動化程度高、準確快速、靈敏度高及信息量大等優勢[7]。產前診斷中常見的臨床指征都適用于CMA檢測，如B超異常、血清學篩查高風險、無創產前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)高風險、不良孕產史、高齡、夫妻一方染色體異常等，因此，對產前診斷臨床指征的準確把握可能是困惑臨床一線醫生的主要原因。本研究通過探討CMA在高危妊娠人群中臨床應用的可行性，指導臨床醫生準確把握產前診斷的臨床指征，并充分做好遺傳咨詢，達到優生優育的目的。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2018～2020年在濰坊市婦幼保健院行介入性產前診斷的孕婦582例，所有孕婦各項輔助檢查無明顯禁忌證，且均簽署產前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 核型分析 在超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取20 ml羊水，1500 rpm離心10 min，收集羊水細胞行常規培養，G顯帶，參考2016年人類細胞遺傳學國際命名體系(International System for Human Cytogenomic Nomenclature，ISCN)進行核型分析及計數。

1.2.2 CMA 在超聲引導下行羊膜腔穿刺術抽取10 ml羊水，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取gDNA，經過SNP array 750K芯片(Affymetrix，美國)檢測，結合Chromosome Analysis Suite (ChAS) 3.2分析軟件和國際常用的公共數據庫(DECIPHER、OMIM、ClinGen、PubMed、DGV)進行檢索和判讀。

1.3 CMA檢測結果的判讀及報告發放 在50kb/25marker缺失，100kb/25marker重復的分辨率水平對樣本進行分析，報告致病變異、可能致病變異和臨床意義未明變異(variants of uncertain significance，VOUS)；不報告全基因組中已知屬于正常多態的拷貝數變化；提示3 Mb以上的雜合性缺失片段；對于判讀為VOUS的拷貝數變異(copy number variation，CNV)片段，建議結合父母驗證結果明確CNV來源，若CNV遺傳自親代，判讀為偏良性的VOUS片段，若為新發變異則需進一步的遺傳咨詢。

1.4 數據統計 采用EXCEL表格錄入數據，統計學處理582例高危妊娠產前羊水樣本的CMA檢測結果，使用計數和頻率描述統計結果。

2 結果

2.1 CMA檢測結果的異常類型分析 582例高危妊娠產前羊水中，CMA共檢出86例致病性和可能致病性變異，共占14.78%；其中常染色體數目異常病例39例，占比45.35%，常染色體雜合性缺失病例6例，占比6.98%，性染色體數目異常病例11例，占比12.79%，致病性CNV病例30例，占比34.88%。在致病性CNV病例中，小片段異常(<10 Mb)病例19例，占比22.09%，占總樣本數量的3.26%(表1)。

表1 CMA檢測結果的異常類型分析(n=86)

2.2 CMA與傳統核型分析檢出異常類型的對比分析 除去6例雜合性缺失病例，CMA檢出的80例異常病例中，常染色體數目異常病例39例，與核型分析檢出一致；性染色體數目異常檢出病例11例，相較于核型分析多檢出2例低比例嵌合病例，可能與培養后的細胞優勢生長有關；致病性片段異常CMA檢出30例，核型分析檢出11例，CMA較核型分析多檢出19例致病性小片段異常(表2)。

表2 80例染色體異常病例的對比分析

2.3 不同羊水穿刺指征的CMA檢出率分析 高危妊娠孕婦的臨床指征可分為B超異常、血清學篩查高風險、NIPT高風險、不良孕產史、夫妻一方染色體異常、高齡和其他(包括孕期服藥、試管嬰兒和孕婦要求等)共7個部分。在不區分多種臨床指征共存的情況下，統計分析發現高齡和NIPT高風險為CMA診斷率最高的臨床指征，共占52.63%；CMA診斷率較低的產前診斷指征包括夫妻一方染色體異常、不良孕產史和其他類型(表3)。

表3 不同羊水穿刺指征的CMA檢出率分析

2.4 CMA與NIPT的對照研究分析 NIPT檢出的173例異常病例中，CMA共確診40例，占比23.12%；統計分析發現性染色體數目異常的符合度最高，假陽性率最低，另外，非目標區域的常染色體數目異常假陽性率最高(表4)。

表4 CMA與NIPT的對照研究分析

2.5 不同B超異常病例的CMA檢出率分析 582例產前羊水中，B超異常病例共有300例，其中CMA確診病例45例(含1例雜合性缺失病例)。按照B超系統分類統計分析發現，多系統異常病例(包含2個及2個以上的B超異常指征)43例，CMA檢出異常病例9例，占比20.93%；單系統B超異常病例257例，CMA檢出異常病例35例，占比13.62%。在不區分B超多系統異常和單統異常的情況下進行常見B超異常指征分類，統計分析發現胸腹部異常(40%)、生長受限(37.5%)、腸管異常(27.27%)、脈絡叢囊腫(22.22%)和胎兒頸部透明帶(NT)異常(21.28%)的CMA檢出率較高，腎臟異常沒有異常病例檢出(表5)。

表5 不同B超異常病例的CMA檢出率分析(例，n=300)

2.6 高危妊娠孕婦的臨床結局分析 隨訪480例病例中，45例隨訪失敗(無致病性病例，致病性病例隨訪率100%)。在隨訪病例中，正?；町a胎兒CMA檢出非整倍體異常病例4例(均為性染色體異常病例)，檢出臨床意義未明CNV(VOUS)異常病例33例，CMA檢測正常病例268例，無致病性CNV病例檢出；引產胎兒CMA檢測非整倍體38例，檢出VOUS異常病例5例，CMA檢測正常病例31例，檢出致病性CNV病例26例；出生異常胎兒CMA檢出非整倍體1例(性染色體異常病例)，檢出VOUS異常病例4例，CMA檢測正常病例20例，檢出致病性CNV病例1例(表6)。

表6 435例隨訪病例的妊娠結局分析[例(%)]

3 討論

孕期檢測發現的血清學篩查高風險、NIPT高風險及B超異常等病例，通過羊水穿刺術，結合產前診斷技術實現對染色體數目及結構異常的準確分辨是非常有臨床價值的；同時，在確定染色體異常來源的情況下，明確的診斷結果可以更好地評估再發風險，指導下一胎生育。本研究的結果顯示，CMA可檢出的染色體異常類型包括非整倍體異常、雜合性缺失異常和染色體微缺失/微重復異常等。另外，CMA相較于傳統的核型分析，可多檢出19例病例，將產前診斷率提升3.26%。與本研究相似，已有很多相關的報道也提到了CMA在產前診斷領域的臨床應用，肯定了CMA在產前診斷領域的應用價值[8，9]。

高危妊娠孕婦的CMA診斷率較高的臨床指征為高齡和NIPT高風險，分別為29.51%和23.12%，其中部分高齡孕婦合并其他異常，這可能是導致高齡孕婦診斷率較高的原因之一；此外，已有大量研究報道表明高齡是主要的產前診斷指征之一[10，11]。NIPT檢測采用新一代高通量測序技術，結合生物信息分析，用于評估胎兒患染色體疾病的風險[12]，準確度較高，是產前篩查與產前診斷的有效補充。本研究顯示，性染色體異常的病例確診率較高，甚至已經超過了NIPT目標疾病(21、18、13染色體數目異常)的診斷率，同時也有研究肯定了NIPT對于性染色體非整倍體的檢測效能[13]。本研究還發現NIPT檢出的85例胎兒染色體片段異常中，經過CMA驗證有20例確診為致病性片段。Pei等[14]的研究顯示NIPT檢測染色體片段異常的陽性預測值(positive predictive value，PPV)為14.89%，提示NIPT可作為胎兒染色體片段異常的篩查方法，CMA是確診胎兒染色體異常片段的最佳方法，NIPT與CMA的聯合應用將會進一步提升染色體異常的檢測效率，進一步奠定其在產前診斷中的應用價值。

本研究中B超異常是主要的產前診斷臨床指征，通過CMA實現對B超異常病例的及時診斷是非常有臨床意義的。通過對B超異常病例的分類分析發現，多系統異常病例的陽性率明顯高于單系統異常病例的陽性率，提示遺傳咨詢中需更加關注B超多系統異常病例，合理開展相關的檢查。此外，相較于傳統的核型分析，針對B超異常病例，CMA可多檢出2.67%的異常胎兒，大大提高異常胎兒的檢出率。隨著CMA在產前診斷中的深入應用，中外權威機構先后出臺了相應指南規范，推薦CMA為產前B超異常胎兒遺傳學檢測的首選方法[4,15]。然而，目前國內相關的臨床數據仍需要更多的積累，來進一步證實CMA在產前診斷中的應用價值。

雖然CMA可以檢出更多的染色體異常，但是CMA的高分辨率也會檢出較多的臨床意義未明CNV，又稱VOUS，給孕婦造成巨大的精神壓力，可能會導致不必要的引產。因此，應嚴格界定產前診斷的臨床指征，且在進行產前診斷前充分做好遺傳咨詢[16]。本研究中約有9.11%為臨床意義未明CNV病例，高于國外研究VOUS占比不超過5.00%的報道[17]。對本研究VOUS占比高于國外的一些報道進行分析，我們發現，需要通過及時結合新指南調整VOUS片段的報告標準，減少不必要的VOUS片段報告；進一步完善父母驗證的臨床路徑，排除家族良性的可能；另外，需要多中心合作，積累中國人群的檢測數據，完善基于中國人群的本地化數據庫，提高國內產前診斷基因芯片診斷的質量。

本研究435例隨訪病例中，正?；町a的胎兒VOUS病例占10.82%(33/305),提示CMA檢出VOUS病例有些是沒有致病意義的，因此，檢測后的遺傳咨詢為至關重要的環節，需謹慎對待，本研究為產前遺傳咨詢指導優生優育提供了重要的數據支撐。出生異常胎兒CMA檢測正常的病例占76.92%(20/26)，一是考慮CMA不能檢測點突變和平衡性結構重排等異常，二是考慮遺傳因素為胎兒缺陷的主要原因，不能排除環境污染、病毒感染、濫用藥物、生活習慣等其他因素導致的胎兒缺陷。提示產前遺傳咨詢需結合孕婦的生活工作環境等因素綜合評估胎兒的生長情況，切實做好出生缺陷防控工作。

4 結論與展望

染色體異常是導致胎兒畸形的重要原因之一，針對染色體異常檢測發展出了不同的檢測方法，如核型分析可檢出大片段染色體異常和平衡性結構重排，CMA可檢出小片段的染色體變異，全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)可檢出基因點突變，這些技術的聯合應用基本可以檢出常見的遺傳性變異，而CMA在其中扮演著非常重要的角色。同時也說明每項技術都有其局限性，正如NIPT檢測準確性較高，但仍屬于篩查，不能替代羊膜腔穿刺術[18]，同樣也不能取代血清學篩查。因此，實現多技術的聯合應用，可為孕婦提供更全面客觀的臨床信息，有助于臨床醫生做出更準確的判斷，提出更合理的建議，進而為降低出生缺陷貢獻力量，同樣這也為臨床實驗室提出了更高的要求，想必也是大勢所趨。

本研究由于樣本量有限，部分結果可能與現有報道存在一定的差異，為進一步提高數據的可信度，未來需要統計更多的臨床病例或者開展多中心合作。