低深度全基因組測序在大慶地區產前診斷的應用價值探討

王淑莉 邵靜 宋一麗 徐志文 劉明媚 佟香艷

(黑龍江省大慶油田總醫院 產前診斷中心，黑龍江 大慶 163001)

我國是一個世界人口大國，也是出生缺陷的高發國家。尤其是隨著“二孩政策”的開放后，高齡孕婦在逐漸增多，導致出生缺陷防控壓力也在不斷增大。大慶市位于黑龍江省西部地區，其中黑龍江省每年約有出生缺陷患者1萬人左右，其出生缺陷人口數量較大。部分出生缺陷可以通過治療干預緩解或改善疾病的不良后果，但重大的出生缺陷目前缺乏有效的治療措施，給家庭和社會帶來巨大的負擔。因此研發出有效的技術進行產前診斷對于降低新生兒出生缺陷率具有重要意義[1]。在所有新生兒出生缺陷的疾病中，染色體疾病是其中最為嚴重的一類[2]。在以前的產前診斷中，本院利用染色體核型分析和熒光原位雜交技術對羊水進行分析和檢測，但是無法滿足當前的工作需求[3]。對此，本文主要分析低深度全基因組測序在大慶地區產前診斷的應用價值，現將研究內容報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇大慶油田總醫院于2020年1月1日至2020年12月31日的200例行羊膜腔穿刺產前診斷的妊娠孕婦和50例流產物絨毛組織進行檢測分析。妊娠孕婦納入標準：胎兒超聲顯示結構異常；產前篩查高風險；高齡孕婦(預產期年齡≥35周歲)；孕婦及其配偶任意一方具有染色體疾病的家族史；孕婦具有染色體疾病患兒的生育史；孕婦曾生育過死胎，或具有多次不明原因流產史[4]；同意接受隨訪至產后6個月。排除標準：合并感染性疾病或凝血功能障礙疾病、陰道流血、流液或腹痛、胎盤前置伴出血、羊水過少、孕婦當日體溫≥37.3 ℃。流產物絨毛組織納入標準：患者身體健康，單胎，自愿接受流產病因學檢測，年齡在20～40歲，孕齡<12周患者。該研究獲大慶油田總醫院倫理委員會批準，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法 為本次研究中的所有孕婦均實施染色體核型分析聯合低深度全基因組測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)技術，首先進行樣本的采集，羊水取樣在超聲監測下穿刺入羊膜腔，并利用15ml螺口離心管收集25～35ml，密閉后在4℃下保存，并于48h運輸至實驗室。流產物取樣需取黃豆粒大小(50～100g)，線平團隊用生理鹽水多次沖洗，漂洗至無血液成分，并放入EP管中密封保存[5]，于4℃保存及運輸，48h以內運至實驗室處理。將采集部分標本送檢至北京貝瑞和康生物技術有限公司進行聯合檢測。

1.2.1 染色體核型分析技術 取羊水20ml將羊水經37℃培養后收獲，經過消化、低滲、固定等步驟制片編號[6]，做G顯帶(320～400條帶)進行核型分析，必要時加做C顯帶、N顯帶。每例患者每線滴3張玻片，分別計數10個核型，對結構異常核型計數至少30個核型，對數目異常的核型則分析數量加倍。按照《細胞遺傳學國際體制ISCN2016標準》進行描述及診斷。所有操作均雙線進行。

1.2.2 CNV-seq 技術染色體拷貝數變異檢測(可逆末端終止測序法)[7]，基于自主創新的快速簡易建庫方法EZ-GALO保證100%建庫成功率。測序采用Hiseq2500快速檢出結果，不受平臺限制。生物信息學分析采用RUPA對比法快速檢測。孕婦羊水樣本及流產物樣本中全部染色體非整倍體以及大于100kb的DNA拷貝數異常情況。

1.3 觀察指標 觀察染色體核型分析聯合CNV-seq技術的檢測結果(表1)。

表1 染色體核型分析聯合CNV-seq技術的檢測結果

2 結果

本次研究中共有250例樣本，其中200例羊水樣本，50例流產物樣本，對200例羊水樣本進行染色體核型分析聯合CNV-seq技術檢測，50例流產物樣本僅行CNV-seq技術檢測。30例陽性羊水樣本中9例非整倍體染色體CNV-seq和核型分析均發現異常，CNV-seq相比于核型分析多檢出21例微缺失微重復綜合征胎兒：其中7例為明確致病性CNV；10例為致病性未知CNV，夫妻雙方知情同意驗證。結果顯示母源性4人，父源性4人，2人未明確片段來源，經夫妻雙方決定10個胎兒保留，隨訪至生后6個月未見明顯異常；2例可能良性胎兒保留，隨訪至產后6個月未見明顯異常；1例可疑致病夫妻雙方拒絕驗證隨訪至妊娠26周，超聲發現胎兒咽腭部發育不良經夫妻雙方協商終止妊娠。50例流產物樣本中，14例致病性CNV，可致胚胎結構畸形，發育異常以及胚胎停育，進一步夫妻雙方行染色體模型分析及CNV-seq檢測。既可以明確流產的遺傳學病因，可為再次妊娠提供指導意義。

3 討論

大慶市位于黑龍江西南部，是黑龍江省的地級市，隨著其人口素質、經濟水平的不斷提高，婚前檢查、生殖健康檢查、產前檢查及新生兒疾病篩查等方面的檢查率得到了大大提升。但由于大慶市處于東北地區，大部分人們對于出生缺陷的認知不足及對產前診斷意識的淡薄，因此為了做好大慶市的先天性出生缺陷的防治工作，還需要更多的技術支持和深入研究[8]。

其中染色體疾病作為新生兒出生缺陷中最為嚴重的疾病，僅僅依靠核型分析和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization，FISH)等技術，無法涉及染色體微小結構變異的遺傳病診斷，導致不能夠滿足臨床需求。CNV-seq是指應用下一代測序技術對樣本DNA進行低深度全基因組測序，并將測序結果與人類參考基因組堿基序列實施對比后，以此來發現受檢樣本中存在的基因組拷貝數變異。將CNV-seq應用在染色體疾病的產前診斷中，可以得到較好的診斷效果。第一點是由于CNV-seq具有較高的分辨率，可以檢出100kb以上的全基因組拷貝數變異。對于產前染色體病的診斷價值大于核型分析；第二點是由于在已經具備自主開展無創產前檢測(non-invasive prenatal testing，NIPT)的機構，測序設備已有，技術方法成熟；第三是其通量高，成本低，其中一張芯片最高可有效檢測80個樣本；第四是無需進行細胞培養，具有易操作的優勢，相比于核型分析來說其報告周期較短[9]。同時在實施具體的產前診斷中，還可以將染色體核型分析與CNV-seq技術進行聯合應用，這樣可有效提高大慶地區的染色體異?；疾÷室约爱惓＜膊z出率，并能夠幫助患者選擇最佳的產前診斷方案，最終有利于降低大慶地區的新生兒出生缺陷發生率。

綜上所述，低深度全基因組測序在大慶地區產前診斷中具有較高的應用價值，可有效提高出生缺陷高危人群的異常染色體檢出率，與染色體核型分析聯合應用后能夠提高其檢查效率[10]，最終可以為降低新生兒出生缺陷打下堅實的基礎。