miR-155在過氧化氫誘導晶狀體上皮細胞氧化應激損傷中的作用及靶向SIRT1調控機制

牛艷桃 張麗 謝文芳

山西省人民醫院眼科，太原030012

白內障是臨床常見致盲眼病，以晶狀體進行性混濁為主要特征，是導致老年人視力降低及盲的主要原因。動物模型及體外細胞實驗均證實，氧化應激與白內障發生和發展密切相關。晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)凋亡是白內障發生的細胞學基礎，氧化應激狀態下細胞代謝產生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)異常積累，誘發LECs凋亡，導致晶狀體混濁。目前白內障主要通過手術進行治療，尚缺乏預防或延緩白內障進展的有效手段。因此，尋找安全、有效的干預手段延緩白內障進展具有重要意義。微小RNA(microRNA，miRNA)能特異性調控靶基因，在眼部組織生長、功能維持及蛋白表達方面具有重要調控作用。miR-155是一種多功能miRNA，在炎癥、腫瘤及免疫過程中發揮關鍵作用。既往研究顯示，miR-155參與視網膜變性、葡萄膜炎等多種眼部疾病的發生和發展過程。抑制miR-155的表達可減輕腦缺血后海馬炎癥反應和氧化應激損傷，改善神經功能。但miR-155在LECs氧化應激損傷中的作用尚不清楚。本研究擬探討miR-155在過氧化氫(hydrogen peroxide，HO)誘導人LECs HLE-B3氧化應激損傷中的作用及其可能的機制，為臨床治療白內障提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞來源 HLE-B3細胞株購于美國ATCC公司。

1.1.2

主要試劑及儀器 體積分數30% HO(10011218)(上海國藥集團化學試劑有限公司)；miR-155擬似物(miR-155 mimics)及其對照(miR-155 mimics-NC)、miR-155抑制劑(miR-155 inhibitor)及其對照(miR-155 inhibitor-NC)(上海吉瑪制藥技術有限公司)；二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(2'，7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)ROS熒光探針(CA1410)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(BC0170)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)ELISA試劑盒(BC0025)(北京索萊寶科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(GM-040502A，美國Genomeditech公司)；兔抗人沉默信息調節因子相關酶1(silment information regulator factor related enzymes 1，SIRT1)單抗(sc-74465，美國SantaCruz公司)；兔抗人B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cell lymphoma/leukemia-2 gene，bcl-2)單抗(ab32124)、bcl-2相關X蛋白(bcl-2 assaciated X protein，bax)單抗(ab104156)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved-cysteine aspartase 3，cleaved-Caspase-3)多抗(ab2302)、αA晶狀體蛋白多抗(ab4632)、HRP標記的山羊抗兔二抗(ab150077)(英國Abcam公司)。IX53倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國FALS CALIBAR BD公司)；ABI7500實時熒光定量PCR系統(美國ABI公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1

細胞復蘇、培養及鑒定 將液氮中凍存的HLE-B3細胞取出，37 ℃水浴解凍，離心半徑8 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞，加入含有體積分數10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養基，于體積分數5% CO培養箱中37 ℃培養，待細胞融合達80%～90%時進行傳代，2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于后續實驗。取傳代后的細胞，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，蛋白變性后上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉、孵育αA晶狀體蛋白一抗(1∶ 1 000)、二抗(1∶ 5 000)，增強化學發光法(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影，檢測αA晶狀體蛋白表達以鑒定LECs。

1.2.2

MTT法檢測細胞存活率 取對數生長期HLE-B3細胞，調整細胞密度為1×10個/ml，接種于96孔板，培養24 h后，分別加入不同濃度(50、100、200、400、800 μmol/L)的HO，培養24 h，每孔加入20 μl MTT(5%)溶液，繼續培養4 h，加入DMSO 150 μl/孔，充分振蕩10 min，使用酶標儀在490 nm處檢測各孔吸光度(

A

)值，另設不含HO的空白組，計算細胞存活率，細胞存活率=不同濃度HO組

A

值/空白組

A

值×100%。根據細胞存活率篩選出最適HO濃度。每組設置5個復孔。

1.2.3

細胞轉染及分組 取對數生長期細胞，調整濃度為1×10個/ml，接種于6孔板，將細胞分為6個組，其中空白對照組細胞不作處理，模型對照組細胞于100 μmol/L HO條件下培養，miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對照組細胞分別進行相應轉染后于100 μmol/L HO條件下培養。轉染步驟為:分別將1 μg miR-155擬似物、miR-155擬似物對照、miR-155抑制劑或miR-155抑制劑對照與50 μl Opti-MEM混合；將2.5 μl Lipofectamine2000與50 μl Opti-MEM混合；再將2種混合物充分混合，室溫孵育20 min，加至6孔板中，轉染24 h后，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效果。倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化并拍照。

1.2.4

實時熒光定量PCR法檢測細胞中miR-155和SIRT1 mRNA相對表達量 收集各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，將RNA逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量PCR。PCR反應體系：cDNA 2.0 μl，正向、反向引物各0.5 μl，SYBR Select Master Mix 10 μl，加ddHO至總體積20.0 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸5 s，進行40個循環。miR-155正向引物序列為5'-AGCTAGCTAGCG ATCGCAG-3'，反向為5'-CGTAGCATCGATCGATATG-3'；U6正向引物序列為5'-ACGATCGATGCGATATGCATC G-3'，反向為5'-AAGCTAGCGCTACGACGTAGCG-3'；SIRT1正向引物序列為5'-ATCTATCGAGCTCGGATCG AC-3'，反向為5'-AGGCAGCAGCTGCAGATCGAT-3'；β-actin正向引物序列為5'-AAGCTAGCGATTATAG CTAGA-3'，反向為5'-ATCGATGCTAGGCAAGATTA-3'。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。miR-155以U6為內參，SIRT1以β-actin為內參，采用2法計算miR-155和SIRT1 mRNA相對表達量。

1.2.5

流式細胞術檢測細胞凋亡率 取各組細胞，以1×10個/ml密度接種至6孔板，培養24 h，每孔加入500 μl質量分數0.25%胰蛋白酶消化3 min，離心半徑8 cm，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，加入5 μl Annexin和PI染色液，避光4 ℃染色15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，計算凋亡率。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/細胞總數×100%。每組設5個復孔。

1.2.6

DCFH-DA熒光探針法檢測細胞ROS含量 各組細胞于6孔板培養24 h，每孔加入200 μl DCFH-DA，培養箱中靜置30 min，使探針和細胞充分混勻，磷酸鹽緩沖液洗滌，收集各組細胞，酶標儀檢測

A

值(激發波長為488 nm、發射波長為525 nm)；倒置熒光顯微鏡下觀察二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)熒光強度并拍照，熒光越強代表ROS含量越高。每組設5個復孔。

1.2.7

ELISA法檢測細胞培養上清液SOD活性和MDA濃度 各組細胞于6孔板培養24 h，離心半徑8 cm，1 000 r/min離心5 min，收集上清，參照試劑盒說明書步驟，加入SOD、MDA抗體及酶標抗體，洗滌后加入底物顯色液避光染色10 min，終止反應后，使用酶標儀于450 nm處測量

A

值，根據標準曲線計算樣品中SOD活性和MDA濃度。每組設5個復孔。

1.2.8

雙熒光素酶報告基因系統檢測miR-155靶基因表達 采用PicTar以及TargetScan生物信息軟件預測分析miR-155與SIRT1序列之間結合位點，以SIRT1的3'非翻譯區(untranslated region，UTR)插入雙熒光素酶報告基因psiCHECK2中，構建野生型(wild type，WT)psiCHECK2-SIRT1 WT和突變型(mutant type，MUT)psiCHECK2-SIRT1 MUT重組質粒，分別將miR-155擬似物、miR-155擬似物對照、miR-155抑制劑及miR-155抑制劑對照與psiCHECK2-SIRT1 WT、psiCHECK2-SIRT1 MUT共轉染至HLE-B3細胞，檢測相對熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性與內參海腎熒光素酶活性的比值表示。實驗重復3次。

1.2.9

Western blot法檢測細胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量 取各組細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA法對蛋白進行定量，100 ℃水浴變性，蛋白上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完畢后，將蛋白轉印至PVDF膜，質量分數5%脫脂奶粉室溫條件下封閉2 h，加入SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3及β-actin一抗(均1∶ 800稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜，加入HRP標記的相應二抗(1∶ 2 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST溶液洗膜，加入ECL溶液，顯影、定影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對表達量。每組設5個復孔。

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0統計學軟件進行統計分析。本研究中計量資料經Shapiro-Wilk檢驗證實符合正態分布，以表示，采用Levene進行組間方差齊性檢驗。采用均衡分組單因素干預多水平研究設計，空白對照組、模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對照組組間各測量值差異比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-

t

檢驗。miR-155擬似物對照組與miR-155擬似物組、miR-155抑制劑對照組與miR-155抑制劑組相對熒光素酶活性比較均采用獨立樣本

t

檢驗。

P

<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LECs的鑒定

培養的HLE-B3細胞高表達αA晶狀體蛋白(圖1)。

圖1 HLE-B3細胞中αA晶狀體蛋白表達 可見細胞中αA晶狀體蛋白高表達 M：蛋白分子標記Figure 1 Expression of αA-crystallin in HLE-B3 cells αA-crystallin was highly expressed in cells M:protein marker

2.2 不同濃度H2O2干預后細胞存活率比較

MTT檢測結果顯示，不同濃度HO處理細胞存活率總體比較，差異有統計學意義(

F

=289.475，

P

<0.05)。隨著HO濃度增加，細胞存活率逐漸降低，各不同濃度間細胞存活率比較差異均有統計學意義(均

P

<0.05)(表1)，其中100 μmol/L的HO處理細胞存活率接近50%，故后續實驗選取HO的濃度為100 μmol/L。

2.3 各組細胞形態學變化比較

倒置顯微鏡下觀察結果顯示，空白對照組細胞呈長梭形或不規則橢圓形，貼壁生長良好；模型對照組細胞數量減少，死亡細胞懸浮于培養基中，呈圓形，存活細胞部分形態發生改變，細胞邊界模糊不清；miR-155擬似物組細胞數量少于模型對照組，細胞固有形態發生改變；miR-155抑制劑組細胞數量多于模型對照組，細胞生長狀態良好，但仍可見少量死亡細胞；miR-155擬似物對照組和miR-155抑制劑對照組細胞形態與模型對照組相似(圖2)。

圖2 各組細胞形態變化(×200，標尺=100 μm) 空白對照組可見細胞呈長梭形或不規則橢圓形，貼壁生長良好;模型對照組可見細胞數量減少，部分存活細胞形態發生改變，邊界模糊不清;miR-155擬似物組可見細胞數量較模型對照組少，細胞形態發生改變;miR-155抑制劑組可見中等數量細胞及少量死亡細胞;miR-155擬似物對照組和miR-155抑制劑對照組可見細胞形態與模型對照組相似 白箭頭示死亡細胞，黑箭頭示變形細胞 A：空白對照組 B：模型對照組 C:miR-155擬似物對照組 D：miR-155擬似物組 E：miR-155抑制劑對照組 F：miR-155抑制劑組 miR：微小RNAFigure 2 Cell morphology changes in various groups(×200,bar=100 μm) In blank control group,the cells showed long fusiform or irregular elliptical shape,and they grew well adherently.In model control group,the number of cells was reduced,and some surviving cells were deformed with unclear boundary.Fewer cells were seen in miR-155 mimics group compared with model control group and they were deformed.Medium number of cells and a few dead cells were seen in miR-155 inhibitor group.Cell morphology in miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group was similar to model control group White arrows indicated dead cells,and black arrows showed deformed cells A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group miR:microRNA

表1 不同濃度H2O2細胞存活率比較(x±s,%)Table 1 Comparison of cell survival rate at different concentrations of H2O2 (x±s,%)H2O2濃度樣本量細胞存活率0 μmol/L5100.00±1.0050 μmol/L566.15±3.56a100 μmol/L555.38±3.15ab200 μmol/L541.54±2.95abc400 μmol/L527.69±2.58abcd800 μmol/L520.00±2.37abcdeF值289.475P值<0.001 注:與0 μmol/L H2O2比較,aP<0.05;與50 μmol/L H2O2比較,bP<0.05;與100 μmol/L H2O2比較,cP<0.05;與200 μmol/L H2O2比較,dP<0.05;與400 μmol/L H2O2比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) H2O2:過氧化氫 Note:Compared with 0 μmol/L H2O2,aP<0.05;compared with 50 μmol/L H2O2,bP<0.05;compared with 100 μmol/L H2O2,cP<0.05;compared with 200 μmol/L H2O2,dP<0.05;compared with 400 μmol/L H2O2,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) H2O2:hy-drogen peroxide

2.4 各組細胞miR-155和SIRT1 mRNA相對表達量比較

空白對照組、模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155抑制劑組、miR-155擬似物對照組和miR-155抑制劑對照組細胞miR-155和SIRT1 mRNA相對表達量總體比較，差異均有統計學意義(

F

=386.952、356.158，均

P

<0.001)，其中與空白對照組相比，模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑對照組細胞miR-155 mRNA相對表達量升高，SIRT1 mRNA相對表達量表達降低，miR-155抑制劑組細胞miR-155和SIRT1 mRNA相對表達量明顯降低，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組和miR-155擬似物對照組比較，miR-155擬似物組細胞miR-155 mRNA相對表達量明顯升高，SIRT1 mRNA相對表達量明顯降低，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組、miR-155抑制劑對照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細胞miR-155 mRNA相對表達量明顯降低，SIRT1 mRNA相對表達量明顯升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；模型對照組、miR-155擬似物對照組和miR-155抑制劑對照組間細胞miR-155和SIRT1 mRNA相對表達量比較，差異均無統計學意義(均

P

>0.05)(表2)。

2.5 各組細胞凋亡率比較

空白對照組、模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組和miR-155抑制劑對照組細胞凋亡率總體比較，差異有統計學意義(

F

=263.158，

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組、miR-155擬似物對照組、miR-155擬似物組、miR-155抑制劑對照組、miR-155抑制劑組細胞凋亡率均升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組和miR-155擬似物對照組比較，miR-155擬似物組細胞凋亡率升高(

P

<0.05)；與模型對照組、miR-155抑制劑對照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細胞凋亡率降低,差異均有統計學意義(均

P

<0.05)。模型對照組、miR-155擬似物對照組及miR-155抑制劑對照組間細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義(均

P

>0.05)(圖3，表3)。

圖3 各組流式細胞分析圖 A：空白對照組 B：模型對照組 C：miR-155擬似物對照組 D：miR-155擬似物組 E：miR-155抑制劑對照組 F：miR-155抑制劑組 PI：碘化丙啶；FITC：異硫氰酸熒光素Figure 3 Flow cytometry analysis of cells in various groups A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group PI:propidium iodide;FITC:fluorescein isothiocyanate

表3 各組細胞凋亡率比較(x±s,%)Table 3 Comparison of cell apoptosis rate among various groups (x±s,%)組別樣本量凋亡率空白對照組53.16±1.01模型對照組521.57±1.47amiR-155擬似物對照組523.35±1.65amiR-155擬似物組534.57±2.02abcmiR-155抑制劑對照組521.96±1.58amiR-155抑制劑組511.84±1.24abdeF值263.158P值<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型對照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA

表2 各組細胞miR-155、SIRT1 mRNA相對表達量比較(x±s)Table 2 Comparison of the relative expression levels of miR-155 and SIRT1 mRNA among various groups (x±s)組別樣本量miR-155SIRT1 mRNA空白對照組51.00±0.111.00±0.10模型對照組51.66±0.13a0.65±0.07amiR-155擬似物對照組51.63±0.12a0.61±0.08amiR-155擬似物組52.75±0.15abc0.43±0.06abcmiR-155抑制劑對照組51.65±0.14a0.66±0.07amiR-155抑制劑組50.61±0.07abde0.84±0.08abdeF值386.952356.158P值<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型對照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miR:微小RNA;SIRT1:沉默信息調節因子相關酶1 Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA;SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1

2.6 各組細胞ROS含量比較

倒置顯微鏡下觀察結果顯示，空白對照組DCF熒光較弱；模型對照組可見強DCF熒光；miR-155擬似物組DCF熒光較模型對照組明顯增強；miR-155抑制劑組DCF熒光較模型對照組和miR-155擬似物組明顯減弱；miR-155擬似物對照組和miR-155抑制劑對照組ROS含量與模型對照組相似(圖4)?？瞻讓φ战M、模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組和miR-155抑制劑對照組細胞ROS含量總體比較，差異有統計學意義(

F

=163.236，

P

<0.001)。與空白對照組比較，模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組和miR-155抑制劑對照組細胞ROS含量均升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組和miR-155擬似物對照組比較，miR-155擬似物組細胞ROS含量升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組、miR-155抑制劑對照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細胞ROS含量降低，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)。模型對照組、miR-155擬似物對照組及miR-155抑制劑對照組間細胞ROS含量比較，差異均無統計學意義(均

P

>0.05)(表4)。

2.7 各組細胞SOD活性和MDA濃度比較

空白對照組、模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對照組細胞SOD活性和MDA濃度總體比較，差異均有統計學意義(

F

=62.361、73.325，均

P

<0.001)，其中與空白對照組比較，模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對照組細胞SOD活性均降低，MDA濃度均升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組和miR-155擬似物對照組比較，miR-155擬似物組細胞SOD活性降低，MDA濃度升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組、miR-155抑制劑對照組和miR-155擬似物組比較，miR-155抑制劑組細胞SOD活性升高，MDA濃度降低，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)。模型對照組、miR-155擬似物對照組及miR-155抑制劑對照組間細胞SOD活性和MDA濃度比較，差異均無統計學意義(均

P

>0.05)(表5)。

圖4 各組細胞ROS熒光圖(×200，標尺=100 μm) 空白對照組細胞熒光強度較弱，模型對照組細胞熒光增強，miR-155擬似物對照組和miR-155抑制劑對照組熒光強度與模型對照組相似，miR-155擬似物組熒光強度較模型對照組增強，miR-155抑制劑組熒光強度較模型對照組和miR-155擬似物組減弱 A：空白對照組 B：模型對照組 C:miR-155擬似物對照組 D：miR-155擬似物組 E：miR-155抑制劑對照組 F：miR-155抑制劑組Figure 4 ROS fluorescence image of cells in various groups (×200,bar=100 μm) Fluorescence intensity of cells in blank control group was weak;fluorescence intensity of cells in model control group was increased;fluorescence intensity of cells in miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group was similar to model control group;fluorescence intensity of cells in miR-155 mimics group was enhanced compared with model control group;fluorescence intensity of cells in miR-155 inhibitor group was attenuated in comparison with model control group and miR-155 mimics group A:blank control group B:model control group C:miR-155 mimics negative control group D:miR-155 mimics group E:miR-155 inhibitor negative control group F:miR-155 inhibitor group

表4 各組細胞ROS含量比較(x±s)Table 4 Comparison of ROS content among various groups (x±s)組別樣本量ROS熒光A值空白對照組520.68±3.21模型對照組563.52±5.47amiR-155擬似物對照組562.59±5.18amiR-155擬似物組584.57±6.39abcmiR-155抑制劑對照組561.96±5.26amiR-155抑制劑組541.84±4.97abdeF值163.236P值<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型對照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) ROS:活性氧簇 miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) ROS:reactive oxy-gen species miR:microRNA

2.8 雙熒光素酶報告結果

生物信息軟件預測顯示，SIRT1的3'UTR區存在miR-155連續結合位點，靶向序列為5'-AGCAUUA-3'。轉染miR-155擬似物細胞野生型SIRT1相對熒光素酶活性為0.41±0.07，明顯弱于轉染miR-155擬似物對照細胞的1.00±0.11，差異有統計學意義(

t

=7.838，

P

<0.05)；轉染miR-155抑制劑細胞野生型SIRT1相對熒光素酶活性為1.98±0.17，明顯強于轉染miR-155抑制劑對照細胞的1.00±0.12，差異有統計學意義(

t

=8.157，

P

<0.05)。轉染miR-155擬似物與轉染miR-155擬似物對照及轉染miR-155抑制劑與轉染miR-155抑制劑對照細胞突變型SIRT1相對熒光素酶活性比較，差異均無統計學意義(

t

=0.776、0.350，均

P

>0.05)(圖5)。

表5 各組細胞SOD活性和MDA濃度比較(x±s)Table 5 Comparison of SOD activity and MDA concentration in cells among various groups (x±s)組別樣本量SOD[mmol/(min·L) ]MDA (μmol/L)空白對照組552.26±5.231.86±0.39模型對照組523.15±3.45a5.89±0.57amiR-155擬似物對照組522.85±3.62a5.93±0.52amiR-155擬似物組511.75±3.18abc7.12±0.61abcmiR-155抑制劑對照組524.43±3.71a5.85±0.48amiR-155抑制劑組541.09±4.57abde2.94±0.46abdeF值62.36173.325P值<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型對照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;compared with miR-155 mimics nega-tive control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SOD:superoxide dismutase;MDA:malondialdehyde;miR:microRNA

圖5 miR-155靶向調控SIRT1 A：miR-155與SIRT1存在連續結合位點 B：miR-155擬似物和miR-155擬似物對照轉染細胞SIRT1相對熒光素酶活性比較 與miR-155擬似物對照組比較，a P<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) C：miR-155抑制劑和miR-155抑制劑對照轉染細胞SIRT1相對熒光素酶活性比較 與miR-155抑制劑對照組比較，a P<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) SIRT1：沉默信息調節因子相關酶1；UTR：非翻譯區；WT：野生型；miR：微小RNA；MUT：突變型Figure 5 Targeted regulation of SIRT1 by miR-155 A:There were continuous binding sites between miR-155 and SIRT1 B:Comparison of the relative luciferase activity of SIRT1 between cells transfected with miR-155 mimics and miR-155 mimics negative control Compared with miR-155 mimics negative control group,a P<0.05 (Independent samples t test,n=3) C:Comparison of the relative luciferase activity of SIRT1 between cells transfected with miR-155 inhibitor and miR-155 inhibitor negative control Compared with miR-155 inhibitor negative control group,a P<0.05 (Independent samples t test,n=3) SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1;UTR:untranslated area;WT:wild type;miR:microRNA;MUT:mutant type

2.9 各組細胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量及bcl-2/bax比較

空白對照組、模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對照組細胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量及bcl-2/bax總體比較，差異均有統計學意義(

F

=48.596、55.489、15.632、63.281、113.259，均

P

<0.001)。與空白對照組比較，模型對照組、miR-155擬似物組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑組、miR-155抑制劑對照組細胞SIRT1、bcl-2蛋白相對表達量及bcl-2/bax降低，bax和cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組和miR-155擬似物對照組比較，miR-155擬似物組細胞SIRT1、bcl-2蛋白相對表達量及bcl-2/bax降低，bax和cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量升高，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)；與模型對照組、miR-155抑制劑對照組和miR-155擬似物比較，miR-155抑制劑組細胞SIRT1、bcl-2蛋白相對表達量及bcl-2/bax升高，bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量降低，差異均有統計學意義(均

P

<0.05)。模型對照組、miR-155擬似物對照組及miR-155抑制劑對照組間細胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量及bcl-2/bax比較，差異均無統計學意義(均

P

>0.05)(圖6，表6)。

圖6 各組細胞蛋白表達電泳圖 與空白對照組相比，模型對照組、miR-155擬似物對照組、miR-155抑制劑對照組SIRT1、bcl-2蛋白條帶灰度減弱，bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶灰度增強；miR-155擬似物組SIRT1、bcl-2蛋白條帶灰度較模型對照組和miR-155擬似物對照組弱，bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶灰度較模型對照組和miR-155擬似物對照組強；miR-155抑制劑組SIRT1、bcl-2蛋白條帶灰度較模型對照組和miR-155抑制劑對照組強，bax、cleaved-Caspase-3蛋白條帶灰度較模型對照組和miR-155抑制劑對照組弱 1：空白對照組；2：模型對照組；3：miR-155擬似物對照組；4：miR-155擬似物組；5：miR-155抑制劑對照組；6：miR-155抑制劑組 cleaved-Caspase-3：活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3；bax：bcl-2相關X蛋白；bcl-2：B細胞淋巴瘤/白血病-2基因；SIRT1：沉默信息調節因子相關酶1Figure 6 Electrophoretogram of proteins in various groups Compared with blank control group,the band intensity of SIRT1 and bcl-2 proteins was weaker,and the band intensity of bax and cleaved-Caspase-3 proteins was stronger in model control group,miR-155 mimics negative control group and miR-155 inhibitor negative control group.The band intensity of SIRT1 and bcl-2 proteins was weaker and the band intensity of bax and cleaved-Caspase-3 proteins was stronger in miR-155 mimics group than model control group and miR-155 mimics negative control group.The band intensity of SIRT1 and bcl-2 proteins was stronger and the band intensity of bax and cleaved-Caspase-3 proteins was weaker in miR-155 inhibitor group than model control group and miR-155 inhibitor negative control group 1:blank control group;2:model control group;3:miR-155 mimics negative control group;4:miR-155 mimics group;5:miR-155 inhibitor negative control group;6:miR-155 inhibitor group cleaved-Caspase-3:cleaved-cysteine aspartase 3;bax:bcl-2 associated X protein;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2 gene;SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1

表6 各組細胞SIRT1、bcl-2、bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量及bcl-2/bax比較(x±s)Table 6 Comparison of relative expression levels of SIRT1,bcl-2,bax,cleaved-Caspase-3 proteins and bcl-2/bax among various groups (x±s)組別SIRT1bcl-2baxbcl-2/baxcleaved-Caspase-3空白對照組1.06±0.110.87±0.090.71±0.061.14±0.100.36±0.05模型對照組0.65±0.07a0.45±0.07a0.96±0.10a0.46±0.06a0.89±0.09amiR-155擬似物對照組0.63±0.10a0.43±0.06a0.94±0.09a0.44±0.07a0.85±0.08amiR-155擬似物組0.35±0.07abc0.26±0.05abc1.13±0.11abc0.23±0.05abc1.03±0.10abcmiR-155抑制劑對照組0.62±0.09a0.42±0.06a0.93±0.09a0.45±0.06a0.82±0.09amiR-155抑制劑組0.82±0.09abde0.63±0.08abde0.81±0.07abde0.78±0.09abde0.63±0.07abdeF值48.59655.48915.632113.25963.281P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與空白對照組比較,aP<0.05;與模型對照組比較,bP<0.05;與miR-155擬似物對照組比較,cP<0.05;與miR-155擬似物組比較,dP<0.05;與miR-155抑制劑對照組比較,eP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) SIRT1:沉默信息調節因子相關酶1;bcl-2:B細胞淋巴瘤/白血病-2基因;bax:bcl-2相關X蛋白;cleaved-Caspase-3:活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3;miR:微小RNA Note:Compared with blank control group,aP<0.05;compared with model control group,bP<0.05;com-pared with miR-155 mimics negative control group,cP<0.05;compared with miR-155 mimics group,dP<0.05;compared with miR-155 inhibitor negative control group,eP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) SIRT1:silent information regulator factor related enzymes 1;bcl-2:B-cell lymphoma/leukemia-2 gene;bax:bcl-2 associated X protein;cleaved-Caspase-3:cleaved-cysteine aspartase 3;miR:microRNA

3 討論

ROS過度堆積對LECs的損傷是引起白內障的主要因素，可損傷細胞蛋白質、核酸及脂質等成分，誘導細胞凋亡，引起組織損傷，降低細胞中ROS水平可有效防止晶狀體混濁。HO是晶狀體內主要ROS之一，SOD等抗氧化劑可有效清除堆積的ROS，正常情況下，晶狀體中氧化與抗氧化系統處于平衡狀態，隨著年齡增長，房水及晶狀體HO增加，氧化應激損傷超過抗氧化系統，引起晶狀體氧化損傷。MDA濃度與細胞受ROS攻擊程度有關，白內障患者晶狀體中MDA濃度明顯升高。HO處理的LECs可產生明顯氧化應激損傷，同時實驗性白內障大鼠晶狀體中SOD活性明顯低于正常大鼠。以上研究均提示氧化應激損傷參與白內障發生和發展過程。本研究結果顯示，模型對照組細胞ROS熒光

A

值、MDA濃度及凋亡率均較空白對照組明顯升高，而SOD活性較空白對照組明顯降低，證實HO可誘導HLE-B3細胞氧化應激損傷，促進細胞凋亡。

研究證實，miRNA在白內障發生和發展過程中發揮重要作用，有望作為診斷標志物或新的治療靶點。miR-155在眼部組織生長發育以及功能調節方面具有重要作用，Bian等研究顯示，miR-155參與視網膜損傷，與光感受器變性有關。Woeller等報道，miR-155在甲狀腺相關眼病患者眼眶成纖維細胞中的表達高于健康人群。以上研究均表明miR-155與眼部疾病密切相關。本研究結果也顯示，miR-155在HO誘導的HLE-B3細胞氧化應激損傷模型中異常高表達，miR-155抑制劑組細胞生長狀態良好，且凋亡率較模型對照組和miR-155擬似物組明顯降低，提示沉默miR-155對細胞具有保護作用，有利于細胞正常生長發育。Qiu等研究表明，miR-155可通過結合環氧合酶2促進蟑螂過敏原誘導的哮喘小鼠模型中的氧化應激反應。在膿毒癥小鼠模型中，沉默miR-155表達可抑制氧化應激，減輕肝損傷。本研究結果顯示，miR-155抑制劑組細胞ROS含量、MDA濃度較模型對照組和miR-155擬似物組明顯降低，SOD活性明顯增強，提示沉默miR-155可減輕HLE-B3細胞氧化應激損傷。

SIRT1具有調控細胞周期、抗氧化、抗凋亡等作用。Caspase-3可裂解多種功能蛋白，是細胞凋亡的執行者，在HO誘導的氧化應激細胞模型中表達升高。bcl-2可抵抗細胞凋亡，bax可促進細胞凋亡，二者表達水平與細胞凋亡密切相關。SIRT1在眼部角膜、視網膜、晶狀體等組織中表達，與氧化損傷引起的細胞凋亡有關，參與葡萄膜炎、視網膜退行性疾病等眼部疾病的發生和發展過程。臨床研究表明，SIRT1在年齡相關性白內障患者LECs中低表達，促使細胞凋亡，加速疾病發展。動物實驗顯示，糖尿病白內障小鼠LECs中SIRT1表達明顯低于正常小鼠，可抑制細胞增生，并促進細胞凋亡。促進SIRT1表達或使用SIRT1激動劑可減少氧化應激導致的LECs損傷，預防白內障發生。本研究結果表明，HO誘導氧化應激損傷細胞中SIRT1、bcl-2蛋白表達水平及bcl-2/bax降低，bax、cleaved-Caspase-3蛋白升高，均提示SIRT1參與細胞氧化應激損傷及凋亡過程，與劉金泉等研究SIRT1參與帕金森模型細胞凋亡和氧化應激損傷的結果一致。同時本研究經雙熒光素酶實驗驗證miR-155與SIRT1存在靶向性，與李世勛等研究miR-155靶向SIRT1調控缺血性心肌細胞的結果相似，提示miR-155可靶向調控SIRT1表達，且沉默miR-155可減輕細胞氧化損傷，減少凋亡。

綜上所述，本研究結果表明miR-155在HO誘導的HLE-B3細胞氧化應激損傷模型中高表達，沉默miR-155可減少細胞凋亡，減輕氧化應激損傷，其可能是通過靶向調控SIRT1表達水平發揮細胞保護作用，為臨床治療白內障提供新的靶點和實驗依據。但本研究僅針對細胞氧化損傷模型進行探討，未建立動物模型，未來需進一步探討miR-155在體內對晶狀體混濁的作用及可能機制。

利益沖突

所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻聲明

牛艷桃：實驗設計和實施、文章撰寫；張麗：實驗設計、文章修改及定稿；謝文芳：實驗實施、數據采集及分析