2型糖尿病患者血清磷脂DHA與炎癥因子相關性研究

傅晶蕾　褚晨吟　周國忠　樓大鈞

[摘要] 目的 研究2型糖尿病患者血清磷脂DHA與炎癥因子核因子-κB（NF-κB）、干擾素-γ（IFN-γ）是否具有相關性。 方法 選取2019年10月至2021年1月期間浙江省紹興市人民醫院內分泌科收治的2型糖尿病患者53例（T2DM組）和2020年11～12月浙江省紹興市人民醫院體檢中心健康者51例（NC組），用高效氣相色譜法測定血清磷脂DHA，流式細胞儀檢測NF-κB及IFN-γ水平。比較兩組的血清磷脂DHA、NF-κB及IFN-γ水平，分析血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ的相關性。結果 T2DM組NF-κB表達水平明顯高于NC組[5.79（4.21，9.02）% vs. 1.81（1.26，4.18）%，P<0.01]。T2DM組IFN-γ濃度明顯高于NC組[11.94（9.61，15.67）pg/ml vs. 7.51（6.37，9.48）pg/ml，P<0.01]。T2DM組血清磷脂DHA水平明顯低于NC組[（4.57±1.30）% vs. （6.51±1.28）%]，P<0.01）。Spearman相關性分析示血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ呈負相關（r=-0.294，-0.302，P均<0.01）。 結論 2型糖尿病患者血清磷脂DHA與健康者存在差異，血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ呈負相關。

[關鍵詞] 2型糖尿病;二十二碳六烯酸;核因子-κB;干擾素-γ

[中圖分類號] R587.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2022）15-0122-04

Correlation between serum phospholipid DHA and inflammatory factors in patients with type 2 diabetes mellitus

FU Jinglei CHU Chenyin ?ZHOU Guozhong LOU Dajun

1.Department of Endocrinology，Shaoxing People′s Hospital in zhejiang Province the First Affiliated Hospital of Shaoxing University，Shaoxing 312000，China;2.College of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310011，China;3.Department of Clinical Laboratory， Shaoxing People′s Hospital in zhejiang Province the First Affiliated Hospital of Shaoxing University， Shaoxing 312000，China

[Abstract] Objective To investigate the correlations between serum phospholipid DHA and inflammatory factors of nuclear factor-κB （NF-κB） and interferon-γ （IFN-γ） in patients with type 2 diabetes mellitus. Methods A total of 53 patients with type 2 diabetes mellitus （the T2DM group） who were admitted to the Department of Secretion and Metabolism of Shaoxing People′s Hospital from October 2019 to January 2021 and 51 healthy subjects （the NC group） who were admitted to the Physical Examination Center of Shaoxing People′s Hospital from November to December 2020 were selected. Serum phospholipid DHA was determined by the high-performance gas chromatography and NF-κB and IFN-γ levels were determined by the flow cytometry.Serum phospholipid DHA， NF-κB and IFN-γ levels were compared between the two groups，and the correlations between serum phospholipid DHA and NF-κB and IFN-γ were analyzed. Results The expression level of NF-κB in the T2DM group was significantly higher than that in the NC group[5.79（4.21， 9.02） % vs. 1.81 （1.26， 4.18） %， P<0.01]. The IFN-γ concentration in the T2DM group was significantly higher than that in the NC group [11.94 （9.61， 15.67）pg/ml vs. 7.51 （6.37， 9.48） pg/ml，P<0.01]. The serum phospholipid DHA level in the T2DM group was significantly lower than that in the NC group [（4.57±1.30） % vs. （6.51±1.28） %，P<0.01]. The Spearman correlation analysis showed that serum phospholipid DHA was negatively correlated with NF-κB and IFN-γ（r=-0.294，-0.302，P<0.01）. Conclusion Serum phospholipid DHA of type 2 diabetes mellitus patients is different from that of healthy subjects， and serum phospholipid DHA is negatively correlated with NF-κB and IFN-γ.

[Key words] Type 2 diabetes mellitus （T2DM）; Docosahexaenoic acid （DHA）; Nuclear factor-κB （NF-κB）; Interferon-γ （IFN-γ）

目前認為核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）[1]、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）[2]等炎癥因子與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）發病機制之間有著密切的聯系。在糖尿病疾病進程中膳食脂肪酸也起到重要作用，尤其是n-3多不飽和脂肪酸，可以一定程度上改善進行性胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、降低炎癥反應，對疾病發展具相對程度的保護作用。在前期研究中，筆者發現n-3多不飽和脂肪酸可以起到降低血清高敏C-反應蛋白水平的作用，從而減輕T2DM炎癥反應[3]。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）在n-3多不飽和脂肪酸中有著重要地位。在外周血中，DHA與磷脂結合形成磷脂脂肪酸，能夠顯示出體內n-3多不飽和脂肪酸的攝入情況[4]。因此，本研究通過測定外周血血清磷脂DHA和炎癥因子NF-κB、IFN-γ，分析血清磷脂DHA與炎癥因子NF-κB、IFN-γ表達間的相關性，以提供T2DM相關膳食指導，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年10月至2021年1月期間浙江省紹興市人民醫院內分泌科收治的T2DM患者53例（T2DM組），年齡18～70歲。納入標準：①參照1999年WHO制定的標準，納入研究對象的患者均達到了糖尿病診斷要求[5];②經治療的藥物（如降高血壓藥）穩定超過3個月以上。排除標準：①目前仍在使用各類降糖藥物進行治療，但不包括正在使用外胰島素或胰島素增敏劑等;②既往無阿司匹林，維生素A、E、C的服用史，或使用過各類抗氧化藥物;③無合并急性并發癥，未罹患惡性腫瘤，處于妊娠期，或患血液系統疾病，肝腎功能不全。選取51例（NC組）于2020年11～12月來自浙江省紹興市人民醫院體檢中心健康者，年齡20～65歲。排除標準：①研究對象OGTT試驗排除糖尿病[5];②均無明確的心臟、肝臟、肺部及腎臟等疾病，伴有急、慢性進行性感染，惡性腫瘤等情況;③均無糖尿病、高血壓家族史。本研究中，向各研究對象說明實驗情況，獲得知情同意且相關材料提交后經由筆者醫院醫學倫理委員批準（倫理編號：20211203150 0000348155）。

1.2 體格檢查

由專業人員測量實驗人員的身高、體重、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP），并計算出相應的體質量指數（body mass index，BMI）。

1.3 血生化檢測

研究對象空腹狀態下（過夜禁食10～12 h）抽取適量的靜脈血，從中測量糖化血紅蛋白（HbA1c）含量，獲得FPG、FINS等生化指標數據。采用G8糖化血紅蛋白測定儀（日本東曹公司）來測定HbA1c、AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）測定FPG、I2000發光儀（美國雅培公司）測定FINS。

1.4 NF-κB的測定

研究對象空腹狀態下（過夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨靜脈血。2 h內加入2 ml Ficoll細胞分離液（美國GE Healthcare公司），設置離心轉速為2000 r/min，離心時間10 min后吸取單核細胞層，加入10 μl CD14抗體（鼠抗人），在2～8℃冰箱內孵育約30 min，隨后3000 r/min離心，時間為5 min，洗滌離心后去上清液，隨后加入細胞破膜劑，轉速和時間同前，離心洗滌去上清后加入10 μl NF-κB抗體（鼠抗人），在2～8℃冰箱內孵育約40～50 min，最后洗滌離心后得到的樣本加入PBS固定液，使用Navios流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）進行檢測，儲存并以 Cell Quest 軟件系統分析結果。所使用到的NF-κB檢測試劑從美國BD公司采購，在執行相關使用操作時，嚴格遵守操作規程和操作說明書。

1.5 IFN-γ的測定

研究對象空腹狀態下（過夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨靜脈血，2 h內在3000 r/min的離心速度下離心10 min，分離血清，從血清中抽取適量用作研究，另取適量標準品，分別向其中加入表面包被有IFN-γ的熒光強度的捕獲微球和帶有PE熒光標記的抗體結合體，形成雙抗夾心復合物，再由Navios流式細胞儀分析測定樣本中的細胞因子成分及其含量。所使用到的IFN-γ檢測試劑從美國BD公司購置，在執行相關使用操作時，嚴格遵守操作規程和操作說明書。

1.6 血清磷脂DHA測定

研究對象空腹狀態下（過夜禁食10～12 h）抽取2 ml次晨靜脈血，2 h內在3000 r/min的離心速度下離心10 min，分離血清，從血清中提取適量總脂用作研究，經萃取后，使用薄層色譜法將磷脂脂肪酸分離出來，而后經甲酯化處理的磷脂脂肪酸注入高效氣相色譜儀中進行分析，并采集相關譜圖，通過N2010色譜工作站處理后得到最終的分析結果。最后，在將標準品與其對照對照定性，獲得峰面積數據（面積歸一化法），從而得到其含量的分布。

1.7 統計學方法

采用SPSS 23.0統計學軟件分析數據，計數資料采用χ檢驗，計量資料如果屬于正態分布，則以均數±標準差（x±s）表示，否則以中位數（四位數間距）[M（Q1，Q3）]表示。在進行組間檢驗時，采用兩個獨立樣本t檢驗、秩和檢驗法。最后再利用Spearman分析得到DHA與NF-κB、IFN-γ的相關性檢驗結果，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T2DM組和NC組臨床指標及生化特征比較

兩組的年齡、性別方面都具有匹配性，兩組FINS比較，差異無統計學意義（P>0.05）。兩組的BMI、SBP、DBP、FBG、HbA1c、NF-κB、IFN-γ比較，差異有統計學意義（P均<0.01），且T2DM組要高于NC組;兩組的血清磷脂DHA比較，差異有統計學意義（P<0.01），且NC組血清磷脂DHA要高于T2DM組（P<0.001）。見表1。

2.2 血清磷脂DHA與炎癥因子相關性

Spearman相關性分析結果顯示，血清磷脂DHA與NF-κB、IFN-γ均呈負相關（r=-0.294，-0.302，P均<0.01）。見表2。

3 討論

炎癥因子在IR及胰腺β細胞損傷中起十分重要作用。NF-κB是一種核轉錄因子，常見于單核細胞細胞質中。當Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）信號通路出現被異常激活的情況后，NF-κB轉變成激活狀態，并移位至細胞核內，調節靶基因的轉錄表達，從而影響胰島素信號轉導通路、降低利用和攝取葡萄糖的效率，導致機體IR形成[6-7]。IFN-γ是由活化T細胞產生，是具有細胞毒作用的細胞因子。在T2DM患者中，胰腺β細胞上Ⅰ類主要組織相容性復合體（major histo-compatibility complex，MHC）抗原分子表達異常，增加胰腺β細胞對細胞毒性T細胞的細胞毒作用的敏感度，易發生免疫性β細胞損傷[8]。此外，IFN-γ可以使跨膜蛋白TLR2和TLR4表達增加，影響炎癥信號傳導，刺激產生炎癥因子，加劇胰島素抵抗惡化[9]。本研究結果顯示，炎癥因子NF-κB、IFN-γ在T2DM患者中顯著增高，表明NF-κB、IFN-γ可能在T2DM疾病炎癥反應中起著重要作用。

DHA是一種重要的n-3多不飽和脂肪酸。在機體內，胰島素調節作用受損主要表現在葡萄糖轉運、糖原合成和基因表達方面，許多研究表明DHA與IR有密切聯系[10]。Wei等[11]研究發現，DHA可以通過作用于 G蛋白偶聯受體120和過氧化物酶體增殖激活物受體γ進行調節，激活胰島素信號傳遞通路，使得葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）表達效率提高，起到改善IR的作用。相關研究表明，DHA可以通過改變細胞膜上磷脂成分變化，從而影響脂質-蛋白質的相互作用和NF-κB信號傳導通路[12]，尤其抑制NF-κB信號通路在降低炎癥因子水平和減少胰腺β細胞凋亡方面起到重要作用[13-14]。DHA還可以通過調節轉錄因子抑制Th1細胞分化來減少IFN-γ分泌，減輕細胞毒作用，減少靶細胞的免疫性損傷[15-16]。當膳食攝入多不飽和脂肪酸發生改變時體內炎癥因子水平也會相應變化。KolobaricN等[17]在一項隨機研究中發現，添加n-3多不飽和脂肪酸的飲食可以影響受試者體內脂質介質改變以及T淋巴細胞分泌細胞因子水平，最終抑制炎癥反應。另有研究發現，當外源性補充DHA后，可以使細胞膜磷脂中n-3 PUFAs比例增加，通過抑制細胞中磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）來降低花生四烯酸衍生物和炎性代謝產物的產生水平[18-19]。DHA作為人體自身不能合成的必需多不飽和脂肪酸，其獲取途徑主要是飲食攝取。目前許多研究支持其具有抗炎特性，并且具有降低糖尿病患病風險的可能性[20]。本研究中發現，T2DM患者血清磷脂DHA偏低，表明n-3多不飽和酸攝入相對不足、機體抗炎能力相對減弱，而長期的炎癥刺激可能會加劇IR惡化。因此在T2DM患者膳食中增加DHA攝入可能可以降低機體炎癥反應，在一定程度上改善疾病的發展。

綜上所述，NF-κB、IFN-γ可能是糖尿病發病過程中重要的炎癥因子。T2DM患者存在膳食n-3不飽和脂肪酸攝入不合理、抗炎能力下降的情況，而外源性攝入DHA有可能降低炎癥反應，最終減緩疾病進程。但本研究還存在一定的不足，需增加更多研究樣本數量，今后還需開展臨床或基礎研究進一步增加可行性。

[參考文獻]

[1]? ?Lim YJ，Kim JH，Pan JH，et al. Naringin protects pancreatic β-cells against oxidative stress-induced apoptosis by inhibiting both intrinsic and extrinsic pathways in insulin-deficient diabetic mice[J].Mol Nutr Food Res，2018， 62（5）：1522-1533.

[2]? ?Jensen KN，Omarsdottir SY，Reinhardsdottir MS，et al. Docosahexaenoic acid modulates NK cell effects on neutrophils and their crosstalk[J].Front Immunol，2020，11：570 380.

[3]? ?樓大鈞，朱麒錢，斯徐偉，等.新診斷2型糖尿病患者血清磷脂脂肪酸譜與高敏C反應蛋白的相關性研究[J].中國糖尿病雜志，2010，18（6）：464-466.

[4]? ?Liu G，Gibson R.A rapid method for the separation of the phospholipids from the neutral lipids in plasma[J].Pro-staglandins Leukot Essent Fatty Acids，2020，157：102 096.

[5]? ?中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南（2020年版）[J].中華糖尿病雜志，2021，13（4）：315-409.

[6]? ?Li J，Mao YS，Chen F，et al.Palmitic acid up regulates Gal-3 and induces insulin resistance in macrophages by mediating the balance between KLF4 and NF-κB[J].Exp Ther Med，2021，22（3）：1028.

[7]? ?Motolani A，Martin M，Sun M，et al.Phosphorylation of the regulators， a complex facet of NF-κB signaling in cancer[J].Biomolecules，2020，11（1）：15.

[8]? ?Dudek NL，Tan CT，Gorasia DG，et al.Constitutive and inflammatory immunopeptidome of pancreatic β-cells[J].Diabetes，2012，61（11）：3018-3025.

[9]? ?Aly RH，Ahmed AE，Hozayen WG，et al.Patterns of toll-like receptor expressions and inflammatory cytokine levels and their implications in the progress of insulin resistance and diabetic nephropathy in type 2 diabetic patients[J].Front Physiol，2020，11：609 223.

[10]? Wang J，Wang C，Li S，et al. Anti-diabetic effects of inonotus obliquus polysaccharides in streptozotocin-induced type 2 diabetic mice and potential mechanism via PI3K-Akt signal pathway[J].Biomed Pharmacother，2017，95：1669-1677.

[11]? Wei W，Hu M，Huang J，et al.Anti-obesity effects of DHA and EPA in high fat-induced insulin resistant mice[J].Food Funct，2021，12（4）：1614-1625.

[12]? Zgórzyńska E，Stulczewski D，Dziedzic B，et al.Docosahexaenoic fatty acid reduces the pro-inflammatory response induced by IL-1β in astrocytes through inhibition of NF-κB and AP-1 transcription factor activation[J].BMC Neurosci，2021，22（1）：4.

[13]? Vors C，Allaire J，Mejia SB，et al.Comparing the effects of docosahexaenoic and eicosapentaenoic acids on inflammation markers using pairwise and network meta-analyses of randomized controlled trials[J].Adv Nutr，2021，12（1）：128-140.

[14]? Zheng H，Li X，Yang X，et al.miR-217/Mafb axis involve in high glucose-induced β-TC-tet cell damage via regulating NF-κB signaling pathway[J].Biochem Genet，2020，58（6）：901-913.

[15]? Lee J，Choi YR，Kim M，et al.Common and differential effects of docosahexaenoic acid and eicosapentaenoic acid on helper T-cell responses and associated pathways[J].BMB Rep，2021，54（5）：278-283.

[16]? Moloudizargari M，Redegeld F，Asghari MH，et al. Long-chain polyunsaturated omega-3 fatty acids reduce multiple myeloma exosome-mediated suppression of NK cell cytotoxicity[J].Daru，2020，28（2）：647-659.

[17]? Kolobaric N，Drenjan?evicI，MaticA，et al.Dietary intake of n-3 PUFA-enriched hen eggs changes inflammatory markers′ concentration and Treg/Th17 cells distribution in blood of young healthy adults-A randomised study[J].Nutrients，2021，13（6）：1851.

[18]? Ivanisevic M，Horvaticek M，Delmis K，et al.Supplementation of EPA and DHA in pregnant women with type 1 diabetes mellitus[J].Ann Med，2021，53（1）：848-859.

[19]? Fedor D，Kelley DS.Prevention of insulin resistance by n-3 polyunsaturated fatty acids[J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2009，12（2）：138-146.

[20]? Qian F，Ardisson Korat AV，Imamura F，et al.Fatty acids and outcomes research consortium （FORCE）.n-3 fatty acid biomarkers and incident type 2 diabetes：An individual participant-level pooling project of 20 prospective cohort studies[J].Diabetes Care，2021，44（5）：1133-1142.

（收稿日期：2021-09-22）