基于生物信息學探究miR-17-5p 促進三陰性乳腺癌增殖遷移的機制

賀 鑫 陳芳芳 龔鵬舉 宋文靜 楊 燕 錢 晨 何浩東 張京偉

1武漢大學中南醫院甲乳外科/湖北省腫瘤生物學行為重點實驗室/湖北省腫瘤醫學臨床研究中心 湖北 武漢 430071；

2武漢大學基礎醫學院病理生理學教研室 湖北 武漢 430071

乳腺癌是全世界最常見的女性惡性腫瘤之一，嚴重影響女性的生命健康。最新統計數據表明，2020 年全世界新發乳腺癌病例約226 萬，約占全世界新發癌癥病例的11.7%，死亡病例約68 萬例，同時乳腺癌首次取代肺癌（220 萬，11.4%）成為全世界最常見的惡性腫瘤［1］。

乳腺癌是一種高度異質性的腫瘤，其中三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）的侵襲性最高，易出現復發及轉移［2］。由于三陰性乳腺癌中雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體-2（HER-2）均為陰性，患者無法從內分泌治療及抗HER-2 靶向治療中獲益，目前仍以化療為主。高侵襲性及治療藥物的受限導致三陰性乳腺癌患者的5 年死亡率較高，成為了乳腺癌治療的難點。

microRNA 是近年來被廣泛研究的內源性非編碼RNA，長約21～23 nt，可以通過完全或不完全結合靶基因mRNA 的3'UTR 區來抑制靶基因的表達，從而在生物的生長發育及疾病的發生發展中發揮重要作用［3］。在乳腺癌中，已有多個microRNA被報道為增殖、轉移、復發、預后或治療反應的潛在生 物 標 志 物［4］。miR-483-3p 能 通 過 靶 向 癌 基 因HDAC8 抑制人類三陰性乳腺癌細胞的增殖轉移［5］。miR-25-3p 在三陰性乳腺癌組織和細胞系中被上調并能通過靶向BTG2 促進腫瘤增殖，可能作為TNBC 新的診斷和治療靶標［6］。這些研究提示microRNA 在TNBC 的發生發展中發揮重要調控作用，并成為新型診療分子標志物。

本研究通過對腫瘤基因組計劃（The cancer genome atlas，TCGA）數據庫中乳腺癌microRNA 測序數據的分析，篩選出與TNBC 預后相關的特異性差異表達上調microRNA，選取miR-17-5p 作為研究對象，通過相應實驗進行驗證，并結合多個生物信息學數據庫探索miR-17-5p 下游相關靶基因及相關分子機制，從而初步闡釋miR-17-5p 在TNBC 發生發展過程中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析方法

1.1.1數據來源 在UCSC Xena 網站（https：//xena.ucsc.edu/）下載TCGA 數據庫中乳腺癌microRNA IlluminaHiseq 測序數據及對應臨床信息數據。

1.1.2篩選TNBC 預后相關的特異性差異表達microRNA 排除臨床信息不完整及miRNA 測序數據有缺失的病例，按照分子分型篩選出TNBC 及非TNBC 數據，使用R 語言（3.6.2）limma 包分析TNBC 及非TNBC 中癌組織相對癌旁組織的差異表達microRNA，使用Venn 圖篩選出TNBC 的特異性差異表達microRNA，當|log2FC）|＞1 且P＜0.05時認為該microRNA 表達具有顯著性差異。利用在線生存分析網站Kaplan Meier Plotter（https：//kmplot.com/analysis/）采用Kaplan-Meier 方法經Logrank 檢驗，通過計算上四分位數和下四分位數之間所有可能的分界值，選取其中最佳的閾值作為分界點，將患者分為高及低表達兩組，并分析其生存情況，進而篩選出與TNBC 預后相關的差異表達microRNA。

1.1.3分析TNBC 預后相關microRNA 的下游基因 使 用Starbase 數 據 庫（http：//starbase. sysu.edu.cn/index.php）結合多種方法（miRanda：http：//www. microrna. org/microrna/getMicroRNAForm.do，PicTar：https：//pictar.mdc-berlin.de/，miRmap：https：//mirmap. ezlab. org/，Targetscan7.2：http：//www. targetscan. org/vert_72/，PITA：http：/genie.weizmann. ac. il/pubs/mir07/）預測miR-17-5p 的下游靶基因，篩選5 個工具預測結果中的交集靶基因。通過Metascape 及STRING 數據庫對靶基因進行功能及信號通路聚類分析，并構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡。結合在線生存分析網站Kaplan Meier Plotter 對關鍵基因進行生存分析。通過在線網站UALCAN 分析TCGA數據庫不同類型乳腺癌組織樣本中FBXL5 的表達水平。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及轉染 乳腺上皮細胞系MCF-10A 及人乳腺癌細胞系（MCF-7 及MDA-MB-231細胞）購買于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞使用含10% 胎牛血清（Gibco，美國）及1% 青霉素-鏈霉素（Invitrogen，美國）的DMEM（Gibco，美國）完全培養基，在37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中培養。定期換液，待細胞密度為60%～70%時選取處于對數生長期細胞進行轉染。miR-17-5p 的mimics、inhibitor 及 相 應NC 訂 購 于 吉瑪基因，嚴格按照產品說明書轉染，轉染后MDAMB-231 細胞分為：①Mimics-NC 組；②Mimics 組；③Inhibitor-NC 組；④Inhibitor 組。

1.2.2實時熒光定量PCR 收集各組待測細胞，根據RNA 提取試劑盒（北京莊盟生物）說明書提取細胞總RNA。根據逆轉錄試劑盒（Thermo，美國）說明書，逆轉錄合成cDNA。qPCR 使用20 μL 反應體系，包括cDNA 1 μL，2×SYBR Green Mix（Bio-Rad，美國）10 μL，引物0.4 μL，滅菌蒸餾水9 μL。反應條件為：95 ℃3 min、95 ℃12 s、58 ℃15 s、72 ℃30 s，40 個 循 環。以U6 為 內 參，采 用2-ΔΔCT法 計 算miR-17-5p 相對表達量。引物訂購于華大基因：miR17 - 5p：（forward） 5' - AACAGTGCAAAGTGCTTACAGT - 3'，（reverse） 5' - GTCGTATCCAGTGCAGGGT - 3'；U6：（forward） 5' - CTCGCTTCGGCAGCACA - 3'；（reverse） 5' - AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.2.3CCK-8 實驗 細胞轉染12 h 后，按照2×103/孔的密度接種于96 孔板，每組6 個復孔。完全DMEM 培養基常規培養24、48、72 h 后，向每孔中加入10 μL CCK-8 試劑（北京莊盟生物），培養箱靜置2 h 后檢測各組細胞的OD450nm值。

1.2.4劃痕實驗 細胞轉染12 h 后，按照1×105/孔的密度接種于6 孔板，完全DMEM 培養基常規培養，待細胞密度100%時劃線，分別于0、24、48 h 后低倍顯微鏡下拍照記錄。

1.3 統計學方法采用SPSS 24.0 及Graph Pad Prism 7 進行統計分析，研究結果以均數±標準差表示，使用t檢驗和方差分析比較各組間差異，P＜0.05 時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 TNBC 預后相關的特異性高表達microRNA經篩選后共納入67 例TNBC 樣本、334 例非TNBC 樣本及76 例正常乳腺組織樣本。如圖1 所示，經生物信息學分析，共篩選出98 個TNBC 特異性高表達microRNA 及11 個TNBC 特異性低表達microRNA。

圖1 TNBC 中特異性差異表達的microRNA（TCGA）

在98 個TNBC 特異性高表達microRNA 中，進一步篩選出9 個log2FC＞2 的microRNA（表1），并選擇miR-17-5p 做后續分析與研究。通過Kaplan-Meier 方法分析microRNA 與TNBC 總生存期（OS）的相關性。結果表明（圖2）miR-17-5p（HR=1.56，95%CI：1～2.43）高表達與TNBC 患者預后不良顯著相關（P＜0.05）。

圖2 miR-17-5p 在TNBC 中特異性高表達且與不良預后相關

表1 三陰性乳腺癌中特異性高表達的9 個log2FC＞2 的microRNA

2.2 miR-17-5p 在TNBC 細胞中表達特異性升高首先分析了CCLE（cancer cell line encyclopedia）數據庫里不同乳腺癌細胞系中miR-17-5p 的表達水平。結果表明（圖3A），與非TNBC 細胞系相比，TNBC 細胞系中miR-17-5p 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。我們進一步檢測了MCF-10A、MCF-7及MDA-MB-231 細胞中miR-17-5p 的表達水平。如圖3B 所示，與正常乳腺上皮細胞MCF-10A 相比，TNBC 細 胞 系MDA-MB-231 中miR-17-5p 表 達顯著升高（P＜0.001），而Luminal A 型乳腺癌細胞系MCF - 7 中miR - 17 - 5p 表達未顯著升高（P＞0.05）。結果表明，miR-17-5p 在TNBC 細胞中表達特異性升高。

在TNBC 細胞系MDA-MB-231 中轉染miR-17-5p mimics 及inhibitor 后，我們通過RT-qPCR 檢測各組細胞中miR-17-5p 表達水平。如圖3C 和3D 所示，與對照組相比，mimics 組細胞中miR-17-5p 表達水平顯著升高（P＜0.001），而inhibitor 組細胞中miR-17-5p 表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖3 miR-17-5p 在不同類型乳腺癌細胞系中的表達水平

2.3 miR-17-5p 促進TNBC 細胞增殖及遷移能力為了檢測miR-17-5p 對TNBC 細胞增殖及遷移能力的影響，我們分別在TNBC 細胞系MDA-MB-231 中 轉 染miR-17-5p mimics 及inhibitor，通 過CCK-8 實驗檢測不同時間各組細胞的存活情況，劃痕實驗檢測各組細胞劃痕愈合情況。結果表明（圖4），與對照組相比，過表達miR-17-5p 后細胞增殖及遷移能力顯著增強，而抑制miR-17-5p 表達后細胞增殖及遷移能力顯著減弱（P＜0.05）。

圖4 miR-17-5p 對三陰性乳腺癌細胞增殖及遷移能力的影響

2.4 miR-17-5p 靶基因預測及相關調控機制分析使用Starbase 數據庫對miR-17-5p 下游靶基因進行預測，共篩選出407 個交集靶基因。功能及信號通路聚類分析結果表明（圖5A），miR-17-5p 的靶基因涉及到眾多腫瘤相關功能及信號通路，如細胞蛋白降解、蛋白泛素化、細胞周期調節、TGF-β 信號通路等。此外，對構建的靶基因PPI 網絡篩選關鍵子模塊（圖5B），結果主要涉及到5 個子網絡：泛素化及蛋白酶體降解（Ubiquitination & Proteasome degradation）、mRNA 剪接（mRNA Splicing）、受體酪氨酸激酶通路（Signaling by Receptor Tyrosine Kinases）、細胞投射組件（cell projection assembly）及G1中 與Cyclin D 相 關 的 事 件（Cyclin D associated events in G1）。

圖5 miR-17-5p 下游靶基因預測及PPI 網絡

泛素-蛋白酶體途徑在多種腫瘤的發生發展中發揮重要作用，我們選擇此子網絡（模塊1）中的關鍵基因作進一步分析。為了探究泛素-蛋白酶體途徑中關鍵基因對TNBC 患者總生存期的影響，我們使用Kaplan-Meier 方法及Log-rank 檢驗進行生存分析。結果表明（圖6A），FBXL5（F-box and leucine rich repeat protein 5）的低表達與TNBC 患者預后不良密切相關（P＜0.05）。進一步通過UALCAN 在線分析TCGA 數據庫不同類型乳腺癌患者樣本中FBXL5 的表達水平，結果表明（圖6B），與正常乳腺組織相比，TNBC 組織中FBXL5 的表達水平顯著降低。通過Starbase 數據庫進一步分析乳腺癌中miR-17-5p 與FBXL5 表達水平相關性，結果，miR-17-5p 與FBXL5 的mRNA 表達水平顯著負相關（y=-0.244 4x+6.661 9，r=-0.498，P＜0.001）（圖6C）。

圖6 miR-17-5p 下游關鍵靶基因的篩選

由此我們推測，miR-17-5p 可通過抑制泛素-蛋白酶體途徑中關鍵基因如FBXL5 的mRNA 表達水平，促進TNBC 的發生發展，從而影響TNBC 患者的預后。

3 討論

乳腺癌現已超越肺癌成為全世界最常見的惡性腫瘤。而由于具有高侵襲性、治療方案受限等特點，目前三陰性乳腺癌患者的預后依然較差。近年來越來越多的研究表明分子靶向治療在三陰性乳腺癌的治療中可發揮重要的作用，因此對三陰性乳腺癌治療靶點的進一步探索具有重要意義。

將TNBC 組和非三陰性乳腺癌（Non-TNBC）組microRNA IlluminaHiseq 測序數據分別與正常乳腺組織比較后，經韋恩圖分析，篩選出98 個在TNBC 中特異上調的microRNA，選取其中9 個log2FC＞2 的microRNA 進行生存分析，結果表明，miR-17-5p 高表達與三陰性乳腺癌患者預后不良顯著相關。

越來越多的研究表明，microRNA 在癌癥發生的發展中發揮重要作用，成為腫瘤早期診斷、治療和預后評估的重要標志物。在已有研究中，miR-17-5p 在多種腫瘤中具有促癌的作用。如miR-17-5p 可通過靶向下游基因如RUNX3、PDCD4 等促進胃癌細胞增殖和侵襲［7，8］。在鼻咽癌中，miR-17-5p 通過靶向BAMBI 促進腫瘤血管生成［9］。而miR-17-5p在三陰性乳腺癌中的作用并不明確，因此本研究中，我們對miR-17-5p 做進一步探究。

我們首先檢測了正常乳腺上皮細胞及不同類型乳腺癌細胞中miR-17-5p 的表達情況。結果表明，與正常乳腺上皮細胞相比，miR-17-5p 在三陰性乳腺癌細胞中表達特異性升高。為了進一步探究miR-17-5p 對三陰性乳腺癌細胞的影響，我們在MDA-MB-231 中分別轉染miR-17-5p mimics 及inhibitor 后，通過CCK-8、劃痕實驗檢測各組細胞的增殖及遷移能力。實驗結果表明，過表達miR-17-5p后細胞增殖及遷移能力顯著增強，而抑制miR-17-5p 表達后細胞增殖及遷移能力顯著減弱（P＜0.05）。綜上，miR-17-5p 在三陰性乳腺癌中表達升高，且促進三陰性乳腺癌細胞增殖及遷移能力。

為了進一步探究miR-17-5p 促進三陰性乳腺癌細胞增殖及遷移的機制，我們通過多工具對miR-17-5p 下游靶基因進行預測，并篩選出在泛素-蛋白酶體途徑中發揮重要作用的基因FBXL5。FBXL5 是F-BOX 蛋白家族的成員之一，參與E3 泛素連接酶SCF（SKP1 - CUL1 - F box）復 合 物 的 組 成［10］。FBXL5 可通過影響基因轉錄、細胞周期、鐵代謝、DNA 損傷修復、EMT 等過程，影響多種腫瘤的發生發展及耐藥等。在肝癌中，FBXL5 的缺乏可通過影響細胞鐵穩態促進腫瘤的發生［11］。而在結腸癌中，FBXL5 可通過調節PTEN/PI3K/AKT 信號通路促進腫瘤的發展［12］。FBXL5 在乳腺癌中的作用尚不明確。本研究中，生存分析結果表明FBXL5 的低表達與三陰性乳腺癌患者預后不良顯著相關（P＜0.05）。同時，與正常乳腺組織相比，FBXL5在三陰性乳腺癌組織中表達水平顯著降低。在乳腺癌中，miR-17-5p 與FBXL5 的mRNA 表達水平顯著負相關。由此我們推測，miR-17-5p 可通過抑制泛素-蛋白酶體途徑中關鍵基因如FBXL5 的mRNA表達水平，促進三陰性乳腺癌的發生發展，從而影響三陰性乳腺癌患者的預后。

近年來，越來越多的研究對microRNA 在腫瘤發生發展中的作用機制進行探索。本研究通過生物信息學及實驗對miR-17-5p 在三陰性乳腺癌中的作用進行了分析，初步推測miR-17-5p 可通過下調泛素-蛋白酶體途徑中關鍵基因如FBXL5 的表達來促進三陰性乳腺癌的發生發展，為尋找新的三陰性乳腺癌診斷標志物、治療靶點等提供了理論基礎。在后續研究中，我們將進一步探索泛素-蛋白酶體途徑關鍵基因對三陰性乳腺癌的影響，從而明確miR-17-5p 調控三陰性乳腺癌的具體機制。