腎癌免疫治療療效評估突變預測模型的建立

秦彩朋，宋宇軒，丁夢婷，王 飛，林佳興，楊文博，杜依青，李 清，劉士軍，徐 濤

(北京大學人民醫院泌尿外科，北京 100044)

腎癌發病率位居惡性腫瘤的第16位[1]，其病理類型主要分為腎透明細胞癌和非透明細胞癌[2]。超過20%的腎癌患者存在同期遠處轉移，并且近30%行手術切除的患者術后出現復發轉移[3-4]。既往研究結果顯示腎癌存在自發消退可能[5-6]，并且IL-2治療有效[7]，提示腎癌具有免疫原性?；谝陨咸卣?，使得近年來免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitors, ICI)革新了轉移性腎癌的治療。其他癌種免疫組化評估腫瘤PD-L1的表達水平可作為ICI療效預測的生物標志物。然而，腎癌PD-L1表達情況對用藥療效的預測效果存在爭議，如ChecKMate025研究數據接受ICI治療的腎癌患者，PD-L1表達陽性與死亡與否風險并無差異[8]，KEYNOTE 426和ChecKMate214研究中患者PD-L1的表達水平同OS不相關[9-10]。腫瘤突變負荷(tumor mutational burden, TMB)可反映腫瘤新抗原的水平，可預測包括膀胱癌、黑色素瘤和肺癌的ICI用藥效果[11]。在腎癌中，TMB低，因此單獨依靠TMB并不能有效預測腎癌患者ICI的療效[12-13]。

基于目前腎癌缺乏有效評估ICI的手段，本研究擬對公共數據庫中MSKCC泛癌免疫治療隊列腎癌患者的基因組數據進行深入分析，構建療效評估突變預測模型，為腎癌患者接受ICI治療提供用藥參考。

1 資料與方法

1.1 數據來源

121例接受ICI治療的腎透明細胞癌患者全外顯子數據來源于MSKCC免疫治療隊列[11]，從cBioPortal網站獲取(http://www.cbioportal.org/)， 詳見表1。538例腎癌患者轉錄組數據來自于TCGA(the Cancer Genome Atlas Program)網站(https://portal.gdc.cancer.gov/)。

表1 納入分析隊列患者的一般特征Table 1 Clinical characteristics of the included cohorts n(%)

1.2 Cox比例風險模型分析篩選候選突變基因

選取MSKCC免疫治療隊列121例腎癌患者的基因組測序數據進行分析(隨機將患者分為模型訓練組n=60例和驗證組n=61例)， 高頻突變基因(突變率> 5%)納入Cox回歸進行分析。選擇多變量 Cox 回歸分析中P< 0.05的基因與年齡、性別和TMB一并納入訓練組(n=60)構建療效預測模型，構建列線圖校準曲線用于內部驗證，根據回歸系數計算風險評分，將患者分為低風險和高風險兩組。并應用驗證組作為外部驗證隊列來驗證模型，最后將兩隊列進行整合分析。

1.3 TCGA腎癌隊列mRNA表達功能富集分析

應用于R 軟件包“cluster Profiler”進行基因富集分析 (gene set enrichent analysis, GSEA)， 以分析PBRM1和ARID1A野生型和突變型之間的差異表達基因富集通路(FDR<0.25認為具有統計學意義)。應用TIMER2.0對TCGA 隊列538例患者的轉錄組數據進行細胞類型富集分析。

1.4 統計學分析

使用R(版本4.0.4)軟件，包括ggplot2、rms、foreign、survival receiver operating characteristic(ROC)、survival分別用于統計和圖形分析，并使用了Package Survival和Survminer用于生存分析。計量資料采用均數±標準差表示，計數資料采用頻數和百分比表示。計量資料組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗，采用單因素和多因素Cox回歸模型分析高頻突變基因和腎透明細胞癌預后的關聯，采用Kaplan-Meier生存分析和ROC來評估模型的預后價值，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2. 結果

2.1 隊列的臨床特征

研究共納入2個公共數據庫隊列，MSKCC泛癌免疫治療隊列腎癌患者基線特征見表1，接受抗PD-1/PD-L1治療的患者94例，接受抗PD-1/PD-L1和抗CTLA4聯合治療的患者27例。TCGA數據庫腎癌隊列共計538例患者的轉錄組數據納入功能富集分析。

2.2 篩選免疫治療效果相關基因

應用MSKCC泛癌免疫治療隊列腎透明細胞癌患者(n=121)對ICI治療的效果進行評估。高頻突變基因(突變率>5%)納入Cox回歸進行分析。結果顯示PBRM1(突變率45%)和ARID1A(突變率7%)突變與接受ICI治療的腎癌患者的不良預后相關(圖1)， 提示二者可能是ICI治療的不良療效標志物。

圖1 Cox 比例風險分析PBRM1和ARID1A突變與接受ICI治療患者預后的相關性Figure 1 Cox proportional hazard analysis to model association of mutations in PBRM1 and ARID1A with prognosis in patients who are treated with immune checkpoint inhibitors (ICI)

2.3 腎癌免疫表型與PBRM1和ARID1A突變的相關性

為了研究PBRM1和ARID1A突變與免疫調節mRNA表達特征的相關性，本研究對TCGA 538例腎癌患者的轉錄組數據進行基因富集分析，發現PBRM1突變伴隨著免疫相關通路的下調，包括T細胞分化(NES=-1.63，P=0.007)和免疫反應調節(NES=-1.48，P=0.009， 圖2A)。同樣，ARID1A突變伴隨T細胞激活(NES=-1.35，P=0.008)、T細胞介導的細胞毒作用(NES=-1.69，P=0.009)和免疫效應調節通路(NES=-1.27，P=0.041)的下調(圖2B)。細胞類型富集分析結果顯示PBRM1突變組腫瘤微環境免疫浸潤細胞較野生組未見明顯變化(圖3A)，而ARID1A突變組CD8+T細胞水平降低(圖3B)。

A, GSEA between the wild-type and PBRM1 mutation groups; B, GSEA between the wild-type and ARID1A mutation groups.圖2 基因富集分析Figure 2 Gene set enrichment analysis (GSEA)

2.4 整合PBRM1、ARID1A突變和臨床指標預測接受ICI治療腎癌患者的預后

選擇年齡、性別、治療類型、TMB、PBRM1及ARID1A突變狀態6個指標構建療效預測模型(圖4A)， 列線圖線性預測分數=-1.582 9+年齡分數(>60歲=1.973 98或≤60歲=0.986 99)+ 治療類型分數(PD-1/PD-L1=0或Combo=-0.989 6)+性別分數(男性=0或女性=0.174 51)+ TMB分數(TMB×0.014 22)+PBRM1分數(突變=0.657 16或野生=0)+ARID1A分數(突變=1.598 77或野生=0)。ROC分析提示該模型具有良好的準確性(1年AUC=0.700，2年AUC=0.825，3年AUC=0.776，圖4B)， 生存分析結果顯示低風險患者具有更好的OS(P=0.01，HR=4.33，95%CI：1.42～13.23，圖4C)。應用驗證組對預測模型的準確性進行外部驗證，結果顯示模型具有良好的外部有效性(1年AUC=0.604，2年AUC=0.709，3年AUC=0.609，圖4D)，生存分析結果顯示低危組具有更好的OS(P=0.027，HR=2.72，95%CI：1.12～6.64，圖4E)。進一步將模型訓練組與模型驗證組病例整合分析，ROC分析(1年AUC=0.613，2年AUC=0.687，3年AUC=0.526，圖4F)發現低危組具有更好的OS(中位生存時間44個月vs.68個月，P=0.019，HR=2.20，95%CI：1.14～4.26，圖4G)。

圖3 腫瘤微環境免疫細胞浸潤狀態PPBRM1(A)和ARID1A (B)突變誘導的腫瘤免疫微環境浸潤細胞的變化Figure 3 Status of immune cell infiltration induced by mutation in PPBRM1(A) and ARID1A (B)

3 討論

本研究應用MSKCC泛癌免疫治療隊列腎透明細胞癌患者的基因組測序數據進行分析，結果顯示作為SWI/SNF復合體編碼基因的PBRM1和ARID1A基因突變可作為接受ICI治療的腎癌患者用藥療效的預測因子。既往有研究結果顯示存在PBRM1突變的患者對ICI用藥反應良好[12,14]，但是亦有報道的結論與之不同[13,15]，本研究結果提示PBRM1突變患者對藥物反應性較差。相關研究報道ARID1A基因突變與腎癌患者的腫瘤大小、是否轉移以及預后相關[16-17]，并且泛腫瘤研究結果顯示ARID1A突變與ICI療效不佳相關[18]，本研究在腎透明細胞癌的免疫治療隊列中獲得與前人研究一致性的結論。

在腎癌中探究基因突變與腫瘤免疫微環境之間的相關性對揭示ICI治療的機制及其療效評估具有重要價值。本研究應用TCGA中538例腎癌的轉錄組數據進行基因富集分析，結果顯示存在PBRM1和ARID1A基因突變的病例免疫相關信號通路表達下調及CD8+T細胞低浸潤狀態，以上結果可能是PBRM1和ARID1A基因突變導致ICI療效不佳的潛在機制。

A nomogram based on age, gender, treatment type, tumor mutation burden (TMB), PBRM1 and ARID1A mutation status in the patients with renal cell carcinoma in MSKCC immune cohort (training set, n=60) (A), receiver operating characteristic (ROC) curves for predicting overall survival (OS) using the nomogram for the cohort(B), The OS curve with the nomogram for the cohort. The risk score is calculated according to the regression coefficient. According to the risk score, the cohort is divided into low-risk and high-risk score groups for Kaplan-Meier survival analysis(C), ROC curve and OS curve (D-E) of model validation set, ROC curve and OS curve entire set (F-G). FPR, false positive rate; TPR, true positive rate.圖4 構建腎癌免疫治療療效預后模型Figure 4 Construction of an integrated prognostic classifier model

目前腎癌患者仍缺乏有效的ICI療效預測工具。腎癌TMB處于中低水平，中位突變負荷為 1.42 mut/mb[19]，諸多研究結果顯示腎癌TMB并不能單獨作為ICI藥物療效的預測指標[12-13]。此外，有研究結果提出CD8+T細胞浸潤狀態(浸潤型、豁免型和沙漠型)與ICI藥物反應性的關系尚不明確[12, 20-21]，提示腫瘤的內在特征可能與CD8+T細胞浸潤狀態存在交互影響，隨后有一項研究中證實了這一假設[12]，該研究結果提示PBRM1突變與低水平CD8+T細胞浸潤相關，CD8+T細胞浸潤狀態并不能預測患者對ICI治療的反應性，而PBRM1突變則與療效及預后相關，結合本研究的基因富集分析結果提示腫瘤的突變特征可能是免疫浸潤狀態的主導因素，提示本研究在后續的療效預測模型構建中應重點納入突變因素。

綜上所述，本研究整合了年齡、性別、TMB、治療類型、PBRM1和ARID1A突變狀態建立ICI治療的臨床預后模型?；诖藰嫿肆芯€圖多元 Cox 回歸模型，預測模型顯示3年 ROC曲線AUC=0.776，表明模型的預測精度良好。應用風險系數計算風險評分，以中位數將人群分為低危組和高危組，低危組患者的OS顯著長于高危組。使用該方法在驗證隊列及整合隊列進行驗證，結果顯示模型對預測腎癌患者ICI用藥療效的預測價值良好，可以幫助臨床醫生預測ICI的療效，為篩選適宜ICI的腎癌患者提供新的參考。同時本模型有一定局限性，如病例數相對較少，模型穩定性尚需要大樣本病例及臨床實際應用過程中加以驗證。