腦缺血再灌注損傷與線粒體凋亡的研究進展

童英，段小花，楊麗萍，陳普

(云南中醫藥大學云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，昆明 650500)

腦梗死又稱缺血性腦卒中，指各種原因引起的血管受損、閉塞導致的大腦血氧供應受損甚至中斷，局部缺血區域及鄰近受累的腦組織出現缺血缺氧性壞死，患者出現癱瘓、失語等相應的神經功能缺損癥狀的一種急性腦血管疾病，約占急性腦血管疾病的75%，病死率居我國三大高死亡率疾病的首位[1]。腦梗死具有并發癥多、病情重、治療費用高昂、治療周期長等特點，已成為嚴重的全球性疾病。近年來，疏通阻塞血管或恢復患病部位血液供應一直是腦梗死的有效治療方法，但若血流恢復時間超過了再灌注時間窗，反而會加劇腦組織損傷，即發生腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)。再灌注可激活神經元凋亡并導致海馬和皮質損傷，進一步惡化病情，引發腦水腫、腦出血等，使致殘率和致死率進一步升高，嚴重威脅腦梗死患者的生存和預后，給社會與家庭帶來沉重負擔[2]。

腦是一個高能量需求器官，只能通過葡萄糖氧化供能，線粒體既是其產能的重要場所，又是腦組織中最豐富的細胞器，因此線粒體是腦組織能量需求的唯一來源，能量的充足對維持腦功能有重要影響，如釋放神經遞質[3]。研究證明，線粒體異常會加速CIRI，維持線粒體完整性可以保護神經元細胞，減少CIRI的病理進展[4]。目前，以線粒體為靶點進行腦保護已成為研究的熱點，如通過抑制促分裂原活化的蛋白激酶/線粒體凋亡途徑，從而在氧糖剝奪/恢復損傷期間促進海馬神經元活力[5]?，F就CIRI與線粒體凋亡的關系及其靶向研究進行綜述，以期為腦梗死的治療提供新思路。

1 CIRI的病理、生理變化

溶栓治療并非使所有腦梗死患者獲益，部分患者經溶栓治療后病情反而加重，出現CIRI，影響治療效果，因此，了解CIRI在腦梗死治療中至關重要。在腦缺血期間，動脈血流量降低，腦組織缺血、缺氧，腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)合成效率降低，細胞內酸性代謝產物增加，大量活性氧產生，且細胞內Ca2+濃度明顯升高。再灌注期間，血液和氧氣供應恢復后，腦損傷級聯反應被激活，包括線粒體功能障礙及細胞凋亡/壞死、能量障礙、自由基損傷、內質網應激、Ca2+超載、血腦屏障的破壞、炎癥反應、一氧化氮毒性、興奮性氨基酸的毒性作用、基因表達異常等[6-7]，不僅無法恢復已經壞死細胞的功能，還可使受損傷并不嚴重的組織出現不可逆性壞死。其中，線粒體功能障礙是CIRI的最關鍵環節[8]，凋亡/壞死是細胞死亡的主要方式[9]，越來越多的科學研究和臨床證據分析顯示，再灌注后神經元細胞的死亡與線粒體功能障礙引起的凋亡相關[10-13]。

2 再灌注后所致線粒體凋亡

再灌注后機體會啟動各種與細胞死亡相關的程序，如壞死、凋亡或自噬相關的細胞死亡[14-16]。其中，線粒體凋亡途徑被認為是腦缺血后腦損傷的關鍵事件[14]，其具體路徑為再灌注期間線粒體受損，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，Δψm)下降，大量活性氧堆積，B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族促凋亡因子激活，Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、Bak的高表達使線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放，將細胞色素C釋放到胞質中，在脫氧ATP和ATP共同存在的條件下與凋亡蛋白酶活化因子1相互作用，聚合形成凋亡小體，通過胱天蛋白酶(caspase)募集結構域募集到caspase-9前體，從而促進其裂解成活性形式，隨后通過級聯反應激活caspase-3、caspase-6、caspase-7等下游因子，使線粒體不可避免地發生凋亡，最終導致細胞死亡[17]?？梢?，內在凋亡途徑起源于線粒體損傷，且線粒體在整個凋亡過程中發揮核心調節作用，即在某種意義上線粒體決定著神經元細胞的存活和死亡[18]。再灌注后ATP衰竭、活性氧大量堆積、氧自由基損傷、Ca2+超載、mPTP異常開放、Δψm異常、血腦屏障破壞、線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)受損、線粒體自噬等病理過程均可導致線粒體障礙，從而誘導線粒體凋亡通路，導致腦細胞損傷甚至死亡。

3 引起線粒體凋亡的因素

3.1ATP衰竭 能量代謝障礙被認為是CIRI發生的始發環節。腦缺血后，腦內氧分壓持續下降，大部分有氧氧化途徑轉變為無氧糖酵解途徑，ATP合成減少，Na+,K+-ATP酶和Mg2+-ATP酶活性降低，大量乳酸在腦中蓄積，細胞內H+濃度升高，受損組織發生代謝性酸中毒[19]。而過多H+又促使大量自由基產生[20]、細胞內Ca2+濃度升高[21]等，進一步造成組織損傷。

再灌注過程中，腦組織血氧供應恢復，同時大量線粒體損傷，線粒體呼吸鏈破壞，但此時線粒體有氧再灌注的恢復仍不能使腦組織進行有效的有氧氧化產能，導致在再灌注恢復后相當長的一段時間內，糖酵解仍是腦組織的主要產能途徑[22]，該階段酸中毒進一步加重，儲存的能量迅速被消耗，細胞和線粒體進一步損傷，最終導致細胞凋亡。

3.3Ca2+超載 在生理條件下，細胞內Ca2+濃度約為細胞外Ca2+濃度的10 000倍，在體內神經調節及傳遞中起重要作用。再灌注期間，各種不利因素會導致細胞內Ca2+超載。而Ca2+的超負荷可通過以下多種途徑加劇線粒體損傷，并最終導致細胞死亡。①Ca2+超載誘導多種線粒體蛋白的去磷酸化，抑制ATP合成，并加速能量耗竭；②超量的Ca2+也會導致膜電位下降，并使mPTP開放的閾值下降，決定了mPTP的開放程度[28]；③Ca2+超載會釋放大量非酯化脂肪酸，如花生四烯酸，導致線粒體膜的流動性減慢及通透性升高，使線粒體腫脹[29]，腦水腫加重。

3.4mPTP異常開放 mPTP是位于線粒體內、外膜之間的非特異性高導電性通道，主要由線粒體內膜上的腺嘌呤核苷酸轉移酶、線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道、基質上的親環蛋白D及其他蛋白組成的多蛋白復合物[30-32]，其受到基質中Bcl-2蛋白家族中的20多種蛋白、磷酸鹽載體、己糖激酶、肌酸激酶、外周苯并二嗪受體等的調節，維持膜內外離子的相對平衡，控制線粒體膜的通透性，參與保持穩定的電勢差和膜電位的過程。生理情況下，mPTP處于關閉狀態，通過控制線粒體氧化磷酸化來調節能量代謝。

再灌注期間，pH值增加，Ca2+、活性氧濃度逐漸持續升高，導致mPTP持續開放，分子量低于1 500的分子非選擇性進入線粒體內膜[28]，從而破壞了Δψm，與氧化磷酸化解偶聯并導致ATP缺乏和細胞死亡。再灌注也增強了Bcl-2家族相關凋亡因子的激活，通過與電壓依賴性陰離子通道及其他促凋亡蛋白相互作用，形成蛋白滲透性孔，誘導mPTP開放，促進凋亡相關蛋白釋放。mPTP的另一個重要作用是使線粒體膜通透性增加，線粒體腫脹而使線粒體受損[22,33]。有研究表明，阻斷再灌注后mPTP病理性開放是減少神經元細胞凋亡、減輕CIRI的靶點之一[34]。

3.5Δψm異常 由三羧酸循環產生的還原當量還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸分別將電子提供給復合物Ⅰ和復合物Ⅱ，這些電子通過呼吸鏈及復合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ將質子從線粒體基質跨過內膜泵入膜間隙所形成的電位差，即為Δψm。Δψm通過復合物Ⅴ提供質子流入的驅動力，將腺苷二磷酸和無機磷酸鹽濃縮生成ATP[35]。Δψm既是氧化磷酸化過程中能量儲存的中間形式，為ATP合成提供驅動力，也是決定線粒體活性的一個因素，反映線粒體功能的完整性[36]。

研究發現，在缺血環境應激下，線粒體Ca2+聚積，導致細胞色素C和其他線粒體呼吸鏈蛋白的去磷酸化[37]。再灌注過程中，線粒體呼吸鏈過度激活，出現病理性高Δψm，活性氧呈指數級增加，反過來誘導Δψm快速去極化，進一步加重呼吸鏈損傷，最終導致ATP產能障礙，觸發細胞凋亡。目前，應用“溫和解偶聯劑”改善氧化應激水平，維持Δψm的最佳值，糾正線粒體損傷，可能成為腦組織保護的新方向。

3.6血腦屏障破壞 血腦屏障主要由腦毛細血管內皮細胞、星形膠質細胞終足、基底膜及周細胞組成，是控制血液和腦組織間物質交換的復雜細胞系統[38]。正常生理狀態下，絕大多數化合物無法通過血腦屏障進入腦組織，僅有一些脂溶性小分子和氣體分子可以進入，可有效防止有害物質侵入腦組織[39]。血腦屏障的完整性可維持中樞神經系統的功能，防止神經元損傷并改善神經功能[40]。

再灌注時，大量自由基促使細胞膜和毛細血管脂質過氧化，引起血管內皮細胞和基底膜損傷，血腦屏障結構異常、完整性遭到破壞時，血腦屏障通透性增加，大分子物質進入腦組織和血漿成分外滲，導致腦水腫，是導致腦梗死致殘性并發癥的重要原因，直接影響患者預后[41]。

3.7mtDNA受損 線粒體是真核生物細胞中僅16 kb的半自主性細胞器，mtDNA具有獨立于細胞核染色體外的遺傳體系，含37個基因，其出現任何缺失和(或)突變均有可能影響線粒體功能，并導致細胞死亡[42]。mtDNA與氧化磷酸化場所(即線粒體內膜之間的空間)的距離較近，且mtDNA自身結構沒有組蛋白保護、缺乏有效的DNA修復系統，故易受到線粒體呼吸鏈產生的自由基攻擊，導致mtDNA突變[43]。

再灌注時，活性氧暴增，mtDNA與活性氧產生部位鄰近，且mtDNA本身缺乏對損傷的自我修復能力，不能通過對損傷DNA堿基的切除進行修復，易受到活性氧攻擊導致mtDNA缺失和(或)突變，導致線粒體結構破壞和功能受損，最終導致細胞死亡。同時，mtDNA數量減少、線粒體生成能力下降，可引起線粒體氧化磷酸化功能下降，導致神經元細胞因能量匱乏而死亡。

3.8線粒體自噬 線粒體自噬是一種選擇性自噬過程，受到各種因子的精密調節，可識別機體內受損的線粒體并及時清除，是調整線粒體數量的一種重要機制，主要通過PTEN誘導假定激酶1/Parkin介導[44-45]。有研究表明，線粒體自噬對機體的作用是雙向的，在一定程度上，線粒體自噬呈良性表達，通過清除體內異常線粒體，減輕CIRI；但自噬可隨著再灌注導致的病理變化而過度激活，從而加重CIRI[46]。再灌注后，線粒體外膜蛋白Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3表達增加，自噬過度激活，線粒體裂解加速，引發細胞凋亡，加重CIRI[47-48]。

4 治 療

4.1中醫治療 目前，有關腦缺血研究已取得較多進展，中醫藥治療因具有副作用小、高效等優點而受到研究者的關注。有研究證明，桑枝[49]、丹參[50]、燈盞花、細辛[51]、黃芪[52]、天麻等藥物可減輕氧化損傷，進而減輕CIRI；三七總皂苷[53]能降低大鼠腦內Ca2+濃度，并使線粒體跨膜電位升高，阻斷mPTP開放，從而減輕CIRI；牛黃[54]可通過抑制線粒體介導的凋亡信號通路，降低大鼠大腦中Bax、caspase-9、caspase-3和細胞色素C蛋白的表達，對CIRI發揮保護作用。敗醬總黃酮[55]可以改善腦組織能量代謝，減輕自由基損傷，保護腦組織。除傳統中藥外，電針療法也被廣泛用于CIRI的治療。

電針在CIRI中的應用主要包括電針預處理和電針治療兩方面，電針預處理可通過減輕興奮性氨基酸毒性、調控細胞凋亡相關基因等減輕CIRI；電針治療主要通過調節能量代謝、促進血管生成等減輕CIRI[56]。有研究表明，電針預處理可提高Bcl-2表達、降低Bax和caspase-3的表達，使細胞凋亡水平下降，從而抑制大鼠腦組織細胞的凋亡，發揮腦保護作用[57]。此外，電針可通過清除自由基、抑制大鼠腦內的氧化應激，減少過氧化物的產生，保護神經細胞[58]。研究表明，3 mA強度電針可通過調節大鼠腦線粒體的能量代謝減輕大鼠CIRI[59]。電針“百會”“大椎”穴可維持再灌注后線粒體的穩定性，減少凋亡的發生[60]。

4.2西醫治療 細胞、動物和人體研究的新發現表明，胎盤來源的線粒體移植可以減少腦缺血再灌注后的梗死[61]。木犀草素可通過逆轉線粒體腫脹和線粒體跨膜電位增強抗氧化能力[4]。此外，木犀草素可通過激活沉默信息調節因子3/AMP活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白途徑增強線粒體功能，減緩CIRI的病理進展。瑞舒伐他汀通過調控解偶聯蛋白2-沉默信息調節因子3通路減輕再灌注對神經元線粒體的損傷，從而發揮保護作用[62]。馬賽替尼能下調大鼠微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Bax等凋亡蛋白的表達，上調p62的表達，通過抑制線粒體過度自噬減緩CIRI病理進程[63]。

5 小 結

CIRI與線粒體功能障礙密不可分，恢復線粒體的結構和功能有助于CIRI的預防和治療。天麻、丹參等中藥可作用于多靶點，減輕線粒體損傷，對CIRI有保護作用；此外，中醫電針、胎盤來源線粒體移植等技術也在CIRI中相繼應用，且療效明顯?？梢?，從線粒體入手治療對CIRI有重要意義，但目前大多限于基礎研究(細胞水平、動物實驗)，臨床診斷治療應用率低，且線粒體功能障礙涉及復雜的病理過程，諸多文獻僅為單一機制的研究，未來應系統研究線粒體在腦缺血再灌注病理過程中的作用，從而為靶向治療腦梗死提供新思路。