miR-96-5p 靶向叉頭狀轉錄因子O1 對Ishikawa 細胞的作用

馮艷奇，張娥，張蕾，郝頌華，倪婷婷

（1.河南醫學高等?？茖W校婦科教研室，河南鄭州 451191；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院婦產科，河南鄭州 450000；3.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046）

子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤，近年來其發病率呈上升趨勢［1］。目前治療子宮內膜癌的方法主要包括手術切除、放化療法和激素療法［2］。但是，由于晚期轉移性或復發性子宮內膜癌患者失去了手術機會，治療失敗率較高，因此，需要研制新的治療方法。目前，越來越多的分子靶向藥物正在臨床測試應用，且部分藥物已顯示出有效結果［3-4］。微小RNA（microRNA，miRNA）是可以調節一組靶基因并導致翻譯抑制或mRNA 降解的分子［5］。最近的研究表明，子宮內膜癌中大量miRNA失調并調節細胞的生長和轉移，繼而影響腫瘤的發生和發展［6］。有研究發現，miR-96-5p 在結腸癌［7］、卵巢癌［8］和肺癌［9］中的表達均明顯上調，并促進癌細胞的增殖和遷移；miR-96-5p在子宮內膜癌中表達上調，可能與患者不良預后相關［10］。而叉頭狀轉錄因子O1（forkhead box transcription factor O1，FOXO1）在各種癌癥（包括子宮內膜癌）的進展中起抑癌作用［11］。因此，本文主要探討了miR-96-5p 是否通過調控FOXO1影響子宮內膜癌細胞的增殖和侵襲。

1 材料與方法

1.1 臨床組織標本

收集2018 年4 月至2020 年5 月在河南中醫藥大學第一附屬醫院行子宮切除術的50 例患者子宮內膜癌和癌旁正常組織樣本，-80 ℃保存。子宮內膜癌均經病理學確診，且術前未接受過任何其他治療。本研究經河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批件號：HNZYYDXFSYY-2020-029），所有參與者均知情同意。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM 培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（美國Gibco 公司）；Lipofectamine2000 和Trizol試劑（美國Invitrogen 公司）；cDNA 反轉錄試劑盒和SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（日本TaKaRa公司）；CCK-8試劑、RIPA 裂解緩沖液、BCA 試劑盒和ECL發光劑（上海碧云天生物技術有限公司）；兔抗FOXO1 抗體（ab39670）、兔抗細胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗體（ab16663）、兔抗活化多聚ADP 核糖聚合酶（cleaved poly-ADP ribose polymerase，cleaved PARP）抗體（ab32064）、兔抗p21抗體（ab109520）、兔抗波形蛋白抗體（ab92547）、兔抗GAPDH（ab9485）（英國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶偶聯的山羊抗兔二抗（#7074，美國CST 公司）；雙熒光素酶報告系統（美國Promega 公司）。高速低溫離心機（美國Beckman 公司）；Varioskan LUX酶標儀（美國Thermo Fisher公司）；Promotor?實時熒光定量PCR 儀（杭州艾康生物技術有限公司）；Primo Star iLED 顯微鏡（德國蔡司公司）；電泳儀，電轉儀（北京六一生物科技有限公司）；Tanon 3500凝膠成像系統（上海天能公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養及細胞轉染 子宮內膜癌Ishikawa 細胞購自美國菌種保藏中心（American type culture collection，ATCC）。Ishikawa 細胞在含有100 mL∕L FBS 的DMEM 培養基（含100 U∕mL 青霉素和100 μg∕mL 鏈霉素）于37 ℃和50 mL∕L CO2的加濕培養箱中培養。當細胞達到80%融合時，根據Lipofectamine2000試劑說明書進行轉染。向Ishikawa細胞轉染pcDNA、pcDNA-FOXO1、inhibitor NC、miR-96-5p inhibitor、mimic NC、miR-96-5p mimic以及共轉染miR-96-5p mimic 和pcDNA-FOXO1，分別記為pcDNA 組、FOXO1 組、inhibitor NC 組、miR-96-5p inhibitor組、mimic NC 組、miR-96-5p組和miR-96-5p+FOXO1 組，對照組不進行轉染。以上載體和基因序列均由上海吉瑪基因公司設計和提供。

1.3.2 qRT-PCR 檢測正常組織和子宮內膜癌組織中miR-96-5p 和FOXO1 mRNA 的表達 采用Trizol 試劑提取組織標本及轉染細胞的總RNA，然后用分光光度計檢測RNA 純度。根據反轉錄試劑盒說明，取10 ng RNA 用于cDNA 合成。反應程序：16 ℃30 min；42 ℃30 min，85 ℃5 min。使用SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒進行qRT-PCR反 應，程序如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃1 min，40 個循環；以U6 或GAPDH 對照，采用2-ΔΔct法計算miR-96-5p 和FOXO1 的表達。qRTPCR 反應特異性引物如下所示：FOXO1，正向5'-TGGACATGCTCAGCAGACATC-3'，反向 5'-TTGGGTCAGGCGGTTCA-3'；GAPDH，正向5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向 5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；miR-96-5p，正向 5'-ACACTCCAGCTGGGTTTGGCACTAGCACATTT-3'，反向5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6，正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.3.3 Western blot 檢測FOXO1、cyclin D1、cleaved-PARP、p21 和Vimentin 蛋白表達 用RIPA 裂解緩沖液裂解組織，12 000×g離心后收集上清液，BCA測定蛋白濃度。凝膠電泳分離等量的蛋白質并電轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVD）膜。50 g∕L 的脫脂牛奶封閉后，PVDF 膜用抗GAPDH（1：1 000）、FOXO1（1：1 000）、cyclin D1（1：1 000）、cleaved PARP（1：1 000）、p21（1：1 000）和波形蛋白（1：1 000）的一抗4 ℃孵育過夜。然后用辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯的山羊抗兔二抗（1：3 000）在37 ℃下處理2 h，再用化學發光液觀察蛋白條帶。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞活力 將傳至第3～5 代的Ishikawa細胞接種于96孔板內，轉染后各組連續培養24、48、72 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，37 ℃培養2 h后使用酶標儀在450 nm檢測吸光度。

1.3.5 Transwell 小室檢測細胞侵襲情況 每個上室的膜用Matrigel（100 μg∕cm2）包被，然后37 ℃孵育過夜以膠凝。轉染后Ishikawa 細胞重懸于無血清培養基中，并以3×104細胞∕孔密度接種到上層Transwell 室中。下室加入500 μL 含100 mL∕L FBS的DMEM培養基作為化學誘導劑。溫育24 h后，除去未侵襲的細胞，用5 g∕L 的結晶紫對侵襲的細胞進行染色，并于顯微鏡下計數。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因驗證實驗 Targetscan網站預測分析FOXO1 3'UTR 上miR-96-5p 的結合位點。將FOXO1 wt 或FOXO1 mut 質粒分別與mimic NC 或 miR-96-5p mimic使用 Lipofectamine2000 試劑共轉染至Ishikawa 細胞。培養48 h后，按照說明書操作測定細胞裂解液中的熒光素酶活性。

1.4 統計學處理

采用Graphpad 6.0 軟件進行數據統計和分析。結果表示為平均值±標準差（），采用單因素方差分析數據，進一步兩兩比較采用LSD 檢驗；兩個分類變量的關聯程度分析，先采用χ2檢驗，再計算miR-96-5p 表達或FOXO1 表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關聯系數φ或Cramér's V。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-96-5p 和FOXO1 在子宮內膜癌組織中的表達

qRT-PCR 和Western blot 檢測結果顯示，各組FOXO1mRNA 和蛋白表達水平差異有統計學意義（t=23.850，P＜0.001；t=33.99，P＜0.001；圖1），各組miR-96-5p表達水平差異有統計學意義（t=12.550，P＜0.001）。與正常組織比較，子宮內膜癌組織中FOXO1mRNA 和蛋白表達量顯著下調，miR-96-5p表達量顯著上調（P＜0.001）。

圖1 FOXO 1蛋白在子宮內膜癌組織中的表達Fig.1 Expression of FOXO 1 protein in endometrial carcinoma

2.2 miR-96-5p 和FOXO1 表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系

子宮內膜癌患者中miR-96-5p 高表達與病理分級和臨床分期呈正相關（Cramér's V=0.367，P=0.034；φ=0.362，P=0.010），即隨著miR-96-5p 表達升高，病理分級和臨床分期等級越高，而與年齡和是否絕經無明顯相關性（P=0.370，P=0.166）；子宮內膜癌患者中FOXO1 低表達與病理分級和臨床分期呈負相關（Cramér's V=0.389，P=0.023；φ=0.384，P=0.007），即隨著FOXO1 表達降低，病理分級和臨床分期等級越高，與年齡和是否絕經無明顯相關性（P=0.344，P=0.144；表1）。

表1 miR-96-5p和FOXO1表達與子宮內膜癌臨床病理特征的關系Table 1 Relationship between miR-96-5p and FOXO1 expression and clinicopathological features of endometrial carcinoma

2.3 FOXO1 過表達對子宮內膜癌Ishikawa 細胞存活和侵襲的影響

Western blot 實驗結果顯示，各組FOXO1 蛋白表達水平差異有統計學意義（F=123.400，P＜0.001）。與對照組比較，pcDNA 組FOXO1 蛋白表達量變化無統計學意義（P＞0.05），FOXO1 組Ishikawa 細胞中FOXO1 蛋白表達量明顯上調（P＜0.01；圖2A）。CCK-8 結果顯示，各組吸光度值在總體差異上均具有統計學意義（F=17.890，P＜0.001）。如圖2B 所示，與pcDNA 組比較，FOXO1組48 h 和72 h 的細胞活力均明顯降低（P＜0.05）。Transwell 實驗結果表明，2 組侵襲細胞數差異具有統計學意義（t=8.546，P=0.001）。Western blot結果顯示，2 組中各蛋白表達水平差異具有統計學意義（cyclin D1：t=7.298，P=0.002；cleaved PARP：t=5.637，P=0.005；p21：t=5.040，P=0.007；Vimentin：t=8.328，P=0.001）。與pcDNA 組相比，FOXO1 組侵襲細胞數目明顯減少（P＜0.01；圖2C），Cyclin D1 和波形蛋白的表達水平明顯降低，cleaved PARP 和p21 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01；圖2D）。

圖2 Western blot檢測Ishikawa細胞FOXO1蛋白的表達情況Fig.2 Expression of FOXO1 protein of Ishikawa cell detected by Western blot

2.4 抑制miR-96-5p 表達對子宮內膜癌Ishikawa細胞存活和侵襲的影響

qRT-PCR 結果顯示，各組miR-96-5p 表達水平差異有統計學意義（F=137.600，P＜0.001）。與對照組比較，inhibitor NC 組Ishikawa 細胞中miR-96-5p 表達量變化無統計學差異（P＞0.05），miR-96-5p inhibitor 組中miR-96-5p 表達量明顯下調（P＜0.05；圖3A）。CCK-8 結果顯示，各組吸光度值在總體差異上均具有統計學意義（F=10.320，P=0.003）。如圖3B 所示，與inhibitor NC 組比較，miR-96-5p inhibitor組Ishikawa細胞48 h和72 h的細胞活力明顯減弱（P＜0.05）。Transwell 實驗結果表明，2 組侵襲細胞數差異具有統計學意義（t=12.480，P=0.002）。Western blot 結果顯示，2 組中各蛋白表達水平差異具有統計學意義（cyclin D1：t=22.860，P=0.001；cleaved PARP：t=15.760，P=0.003；p21：t=12.280，P=0.002；Vimentin：t=18.070，P=0.001）。與inhibitor NC 組比較，miR-96-5p inhibitor 組侵襲細胞數明顯減少（P＜0.01，圖3C），cyclin D1 和波形蛋白的表達水平明顯降低，cleaved PARP 和p21 蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01；圖3D）。

圖3 抑制miR-96-5p表達對Ishikawa細胞活力和侵襲的影響Fig.3 Effects of inhibition of miR-96-5p expression on Ishikawa cell viability and invasion

2.5 miR-96-5p靶向負調控FOXO1的表達

Targetscan 預測結果顯示，FOXO1 3'UTR 部分序列與miR-96-5p 互補配對（圖4A）。熒光素酶報告基因實驗結果顯示，各組總體差異有統計學意義（F=47.000，P＜0.001）。如圖4B 所示，與mimic-NC+FOXO1 wt 組比較，轉染FOXO1 mut 的細胞熒光素酶活性無明顯變化，miR-96-5p+FOXO1 wt 組細胞熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01）。qRT-PCR和Western blot 檢測結果顯示，各組FOXO1 mRNA和蛋白表達水平差異有統計學意義（F=236.000，P＜0.001；F=148.70，P＜0.001），各組miR-96-5p表達水平差異有統計學意義（F=241.600，P＜0.001）。如圖4C-E所示，與mimic NC 組比較，miR-96-5p 組miR-96-5p表達明顯上調，FOXO1mRNA和蛋白表達明顯下調（P＜0.01）；與inhibitor NC 組比較，miR-96-5p inhibitor 組miR-96-5p 表達明顯下調（P＜0.05），FOXO1mRNA 和蛋白表達明顯上調（P＜0.01）。

圖4 miR-96-5p靶向調控FOXO1的表達Fig.4 miR-96-5p targeted the expression of FOXO1

2.6 miR-96-5p 靶向調控FOXO1 促進Ishikawa細胞的活力和侵襲

CCK-8結果顯示，各組吸光度值在總體差異上均具有統計學意義（F=8.126，P＜0.001）。與對照組比較，miR-96-5p 組Ishikawa 細胞活力明顯升高，與miR-96-5p 組比較，miR-96-5p+FOXO1 組細胞活力明顯降低（P＜0.05；圖5A）。Transwell 實驗結果表明，各組侵襲細胞數差異具有統計學意義（F=37.910，P＜0.001）。Western blot 結果顯示，各組蛋白表達水平差異具有統計學意義（Cyclin D1：F=110.600，P＜0.001；cleaved PARP：F=34.200，P＜0.001；p21：F=81.120，P＜0.001；Vimentin：F=28.660，P=0.001）。如圖5B-D 所示，與對照組比較，miR-96-5p 組侵襲細胞數明顯增多（P＜0.01），cyclin D1 和波形蛋白表達水平明顯升高，cleaved PARP 和p21 蛋白水平明顯降低（P＜0.01），表明細胞凋亡被抑制；與miR-96-5p組比較，miR-96-5p+FOXO1 組侵襲細胞數明顯減少（P＜0.01），cyclin D1和波形蛋白表達水平明顯降低，cleaved PARP和p21蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），表明細胞凋亡被誘導。

圖5 miR-96-5p通過調控FOXO1表達對Ishikawa細胞活力和侵襲的影響Fig.5 Effects of miR-96-5p on Ishikawa cell viability and invasion by regulating FOXO1 expression

3 討論

由于高復發、高轉移、預后差及5 年生存率低，子宮內膜癌的臨床治療已越來越受到關注［3］。叉頭蛋白家族成員FOXO1 轉錄因子是PI3K∕Akt 信號通路調控細胞存活的一個關鍵底物，在細胞的增殖、發育、凋亡和代謝的過程中發揮重要作用［12］。FOXO1 參與了包括子宮內膜癌在內的等多種癌癥的發生發展，與癌癥的進展、侵襲與轉移密切相關［13-14］。MiR-96-3p 在多種腫瘤中發揮癌基因作用，Qin等［15］研究表明miR-96-5p可通過激活MEK∕ERK 信號傳導促進乳腺癌的遷移。Wang等［16］研究表明miR-96-5p 可通過直接靶向FOXF2 促進口腔癌細胞的增殖和侵襲。

本研究結果表明子宮內膜癌組織中miR-96-5p 明顯上調，FOXO1 明顯下調，且在子宮內膜癌中miR-96-5p 高表達或FOXO1 低表達與腫瘤病理分級和臨床分期具有相關性，與患者年齡和是否絕經無明顯相關性。抑癌基因p21 通過停滯細胞周期，阻斷細胞分裂，有利于基因組的損傷后修復［17］。Cleaved PARP 為Caspase 家族凋亡基因啟動子，蛋白表達增加時說明細胞凋亡增加［18］。波形蛋白是間質標志物，在癌癥轉移等過程中發揮了重要作用［19］。過表達FOXO1 或抑制miR-96-5p 表達均明顯抑制Ishikawa細胞的活力、侵襲及Cyclin D1和波形蛋白表達，明顯促進cleaved PARP 和p21 蛋白表達，從而誘導細胞凋亡。上述結果揭示miR-96-5p在子宮內膜癌中發揮促癌作用，而FOXO1 起著抑癌作用。

一系列miRNA（miR-9、miR-27、miR-96、miR-153、miR-182、miR-183）明顯降低了HEC-1B 細胞中FOXO1 的豐度，并促進子宮內膜的腫瘤發生［20］。此外，miR-135通過下調FOXO1明顯刺激了Ishikawa細胞的增殖［21］。本研究結果顯示，miR-96-5p直接靶向負調控FOXO1。miR-96-5p 過表達對Ishikawa 細胞活力和侵襲的促進作用可被過表達FOXO1 所逆轉。因此，miR-96-5p 通過下調FOXO1 的表達水平在子宮內膜癌中發揮促癌作用。

綜上所述，miR-96-5p 在子宮內膜癌中表達上調，FOXO1 表達下調，并與子宮內膜癌的臨床分期和病理分級有關。miR-96-5p 通過靶向負調控FOXO1 的表達促進子宮內膜癌細胞的存活和侵襲，表明miR-96-5p可能成為治療子宮內膜癌的有效靶點。