MEBT／MEBO 對大鼠糖尿病潰瘍創面組織中血管新生的影響研究

魏德華 王 成 陳世玖 劉瓏玲 劉 宇

糖尿病潰瘍是長期高糖環境刺激機體正常組織所致的局部細胞結構受損及功能改變， 常伴有周圍神經血管病變和感染［1］。 近年來隨著對糖尿病潰瘍認識的不斷深入， 部分學者發現新生血管形成過程中斷可導致創面血供不足， 嚴重影響肉芽組織形成及上皮組織再生， 進而延遲糖尿病潰瘍創面的愈合［2－4］， 而血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 作為目前已知促進血管生成的最有效且直接的血管生成因子， 具有誘導內皮細胞增殖、 促進血管重構及血管新生等作用， 在血管新生過程中必不可少［5］； CD34 作為重要的血管內皮細胞標志物， 在血管內皮細胞中呈高表達狀態，可反映創面血管新生情況［6－7］。 諸多臨床研究表明［8－9］， 創瘍再生醫療技術 （moist exposed burn treatment／moist exposed burn ointment， MEBT／MEBO）可促進糖尿病潰瘍創面組織中微血管的形成、 成纖維細胞的增殖與毛細血管的再生［10－11］， 在糖尿病潰瘍創面的治療中取得了較好的臨床療效。 但從VEGF 與CD34 角度分析MEBT／MEBO 作用機制的研究鮮見報道。 鑒于此， 本研究筆者對其進行研究分析， 以期為MEBT／MEBO 的臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

8 ～12 周齡SPF 級雄性SD 大鼠60 只， 體質量220 ～250 g， 均購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司， 并飼養于遵義醫科大學珠海校區清潔級動物實驗室， 室溫控制在20 ～25 ℃， 相對濕度控制在60%， 單籠飼養， 自由飲水、 進食。 本研究經遵義醫科大學珠海校區實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與設備

濕 潤 燒 傷 膏 （moist exposed burn ointment，MEBO）： 汕頭市美寶制藥有限公司生產， 國藥準字Z20000004； 鏈脲佐菌素（streptozotocin， STZ）：北京索萊寶科技有限公司生產； 一次性使用負壓引流護創材料： 蘇州愛得科技發展有限公司生產， 蘇食藥監械 （準） 字2011 第2661009 號； 希迪克HB?V?B?100 便攜式負壓引流器： 河南匯博醫療股份有限公司生產， 豫械注準20172540896； 異氟烷：深圳市瑞沃德生命科技有限公司生產； 免疫組化試劑盒： 江蘇凱基生物技術股份有限公司生產；Rabbit?anti?CD34： 北京博奧森生物技術有限公司生產； VEGF、 β?actin 引物序列： 生工生物工程（上海） 股份有限公司生產； One Step TB GreenTMPrimeScriptTMRT?PCR Kit Ⅱ（SYBR Green）： 日本TaKaRa 公司生產。

2 方法

2.1 模型制備與分組

60 只大鼠適應性飼養1 周后， 禁食12 h， 采用隨機數表法將其隨機分為模型對照組、 MEBO 組和VSD 組， 每組20 只。 所有大鼠均于腹腔注射1% STZ （40 mg／kg） 建立糖尿病模型， 待出現多飲、 多食、 多尿、 體重明顯減輕等癥狀且隨機血糖≥16.7 mmol／L 即視為糖尿病大鼠模型制備成功； 繼而， 3%異氟烷吸入麻醉， 背部備皮、 消毒后， 于背部相同位置做直徑2.0 cm 深達筋膜層的全層皮膚缺損創面。

2.2 創面處理

模型對照組大鼠創面采用凡士林油紗換藥處理， 常規碘伏消毒、 無菌紗布拭凈后， 依次覆蓋凡士林油紗及無菌干紗布包扎固定， 每天換藥1 次；MEBO 組大鼠創面采用MEBO 換藥處理， 常規碘伏消毒、 無菌紗布拭凈后， 均勻涂抹MEBO， 并依次覆蓋MEBO 藥紗及無菌干紗布包扎固定， 每天換藥1 次； VSD 組大鼠創面采用負壓封閉引流（vacuum sealing drainage， VSD） 處理， 常規碘伏消毒、 無菌紗布拭凈后， 放置聚氨脂吸水纖維敷料（放置面積大于創面邊緣0.5 cm） 并固定， 疊瓦式粘貼半透膜， 連接便攜式負壓引流器持續負壓引流， 壓力控制在－100 ～－80 KPa， 每3 d 更換1 次聚氨脂吸水纖維敷料。

2.3 標本采集與處理

分別于干預第7、 14 天， 每組隨機選取6 只大鼠， 于異氟烷麻醉后在超出創緣0.3 cm 處完整切除整塊創面肉芽組織， 并將其均分為2 份后， 一份置于凍存管中， 放入液氮罐保存備用； 一份用濾紙包裹置于包埋盒中， 放入4 ℃冰箱保存備用。

2.4 創面愈合率

分別于干預第3、 7、 10、 14 天， 隨機選取6只大鼠將標尺置于創面邊緣后對創面進行拍照， 使用Image J 軟件測定創面面積， 計算創面愈合率。創面愈合率＝ （創面初始面積－ 時相點創面面積） ／創面初始面積×100%。

2.5 CD34 免疫組化染色檢測創面組織微血管密度（microvascular density， MVD）

取4 ℃冰箱中保存備用的組織， 常規予以脫水、 石蠟包埋、 切片、 脫蠟后進行CD34 免疫組化染色， 于50 倍光學顯微鏡下選取血管密度最高的3個區域， 繼而在200 倍光學顯微鏡下選擇5 個不重疊區域， 計算微血管數量， 取其平均值。

2.6 RT?PCR 技術檢測創面組織中VEGF mRNA 表達水平

取出液氮中凍存的創面組織， 采用Trizol 法將組織充分研磨、 裂解、 離心后提取總RNA， 全自動核酸分析儀測定樣品在260 nm 和280 nm 的光密度 （optical density， OD） 值 以 及 RNA 濃 度，OD260／280 為1.8 ～2.1 視為提取成功； 在10 μl 反轉錄體系中反轉錄合成cDNA 進行PCR 擴增， 擴增條件為95 ℃5 min， 95 ℃15 s， 60 ℃20 s， 72 ℃40 s， 共40 個 循 環； 以 甘 油 醛?3?磷 酸 脫 氫 酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase， GAPDH）作為內參基因， 測得Ct 值， 使用2－△△Ct法計算mRNA 相對表達量。 引物序列： VEGF 上游5’ ?AACCTCACCAAAGCCAGCACAT?3 ’， 下 游 5 ’ ?CCGCTCTGAACAAGGCTCACA?3’； GAPDH 上 游5’ ?AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA?3’， 下游5’ ?CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG?3’。

2.7 統計學處理

采用SPSS 23.0 統計軟件對所得數據進行統計學分析， 符合正態分布的數據以均數± 標準差（±s） 表示， 多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用q檢驗， 均以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 3 組大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率對比

干預第3、 7、 10、 14 天， 模型對照組大鼠創面愈合率均明顯低于MEBO 組與VSD 組（P均＜0.05）； 干預第14 天， MEBO 組大鼠創面愈合率明顯高于VSD 組（P＜0.05）， 其余各時間點MEBO 組與VSD 組間無明顯差異（P均＞0.05）， 詳見表1、 圖1。

圖1 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面愈合情況對比圖Fig.1 Comparison of the healing condition of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points

表1 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率對比（%， ±s）Table 1 Comparison of healing rates of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points （%， ±s）

表1 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率對比（%， ±s）Table 1 Comparison of healing rates of diabetic wounds in rats among the three groups at different time points （%， ±s）

注： MEBO 為濕潤燒傷膏， VSD 為負壓封閉引流； 模型對照組大鼠創面采用凡士林油紗換藥處理， MEBO 組大鼠創面采用MEBO換藥處理， VSD 組大鼠創面采用VSD 處理。 與模型對照組對比，aP ＜0.05， 差異具有統計學意義； 與MEBO 組對比， bP ＜0.05， 差異具有統計學意義Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage； The wounds in control group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Sta?tistically significant differences were observed as compared with control group （aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

組別Group只數Number of rats第3 天Day 3第7 天Day 7第10 天Day 10第14 天Day 14模型對照組Control group 6 11.6 ±2.5 33.8 ±2.3 56.4 ±1.9 79.9 ±1.5 MEBO 組MEBO group 6 17.5 ±1.8a 51.2 ±1.1a 73.0 ±1.9a 92.8 ±1.4a VSD 組VSD group 6 15.8 ±1.8a 49.0 ±1.5a 70.4 ±1.8a 89.7 ±1.9ab F 值F value 13.042 184.677 137.185 104.371 P 值P value ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.2 3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織中MVD 對比

干預第7、 14 天， 模型對照組大鼠創面組織中MVD 均明顯低于MEBO 組與VSD 組 （P均＜0.05）， 且VSD 組大鼠創面組織中MVD 又明顯低于MEBO 組（P均＜0.05）， 詳見表2。 干預第7天， 模型對照組大鼠創面組織中可見極少量散在分布的棕黃色顆粒， 而MEBO 組和VSD 組大鼠創面組織中均可見較多密集分布的棕黃色顆粒； 干預第14 天， 模型對照組、 MEBO 組、 VSD 組大鼠創面組織中均可見大量密集分布的棕黃色顆粒， 且MEBO組和VSD 組棕黃色顆粒量明顯多于模型對照組， 詳見圖2。

圖2 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織CD34 免疫組化染色圖（ ×400）Fig.2 Immunohistochemical staining of CD34 in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ×400）

表2 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織中MVD 對比（條／mm2， ±s）Table 2 Comparison of MVD in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （microvessel／mm2， ±s）

表2 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織中MVD 對比（條／mm2， ±s）Table 2 Comparison of MVD in diabetic wound tissues of rats among the three groups at different time points （microvessel／mm2， ±s）

注： MEBO 為濕潤燒傷膏， VSD 為負壓封閉引流， MVD 為微血管密度； 模型對照組大鼠創面采用凡士林油紗換藥處理， MEBO組大鼠創面采用MEBO 換藥處理， VSD 組大鼠創面采用VSD 處理。與模型對照組對比， aP ＜0.05， 差異具有統計學意義； 與MEBO 組對比， bP ＜0.05， 差異具有統計學意義Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage， MVD－microvascular density； The wounds in control group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Statistically significant differences were observed as compared with control group （ aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

組別Group只數Number of rats第7 天Day 7第14 天Day 14模型對照組Control group 6 33.81 ±1.49 45.65 ±5.98 MEBO 組MEBO group 6 59.58 ±2.64a 76.33 ±4.70a VSD 組VSD group 6 49.22 ±5.42ab 64.19 ±3.08ab F 值F value 78.480 63.815 P 值P value ＜0.001 ＜0.001

3.3 3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織中VEGF mRNA表達水平對比

干預第7、 14 天， 模型對照組大鼠創面組織中VEGF mRNA 表達水平均明顯低于MEBO 組與VSD組（P均＜0.05）， VSD 組大鼠創面組織中VEGF mRNA 表達水平又明顯低于MEBO 組 （P均＜0.05）， 詳見表3。

表3 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織中VEGF mRNA 表達水平對比（ ±s）Table 3 Comparison of expression levels of VEGF mRNA in wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ±s）

表3 不同時間點3 組大鼠糖尿病潰瘍創面組織中VEGF mRNA 表達水平對比（ ±s）Table 3 Comparison of expression levels of VEGF mRNA in wound tissues of rats among the three groups at different time points （ ±s）

注： MEBO 為濕潤燒傷膏， VSD 為負壓封閉引流， VEGF 為血管內皮生長因子； 模型對照組大鼠創面采用凡士林油紗換藥處理，MEBO 組大鼠創面采用MEBO 換藥處理， VSD 組大鼠創面采用VSD處理。 與模型對照組對比， aP ＜0.05， 差異具有統計學意義； 與MEBO 組對比， bP ＜0.05， 差異具有統計學意義Note： MEBO－moist exposed burn ointment， VSD－vacuum sealing drainage， VEGF－vascular endothelial growth factor； The wounds in con?trol group were treated with dressing change of Vaseline gauze， wounds in MEBO group were treated with dressing change of MEBO， and wounds in VSD group were treated with VSD. Statistically significant differences were observed as compared with control group （ aP ＜0.05） and with MEBO group （bP ＜0.05）

組別Group只數Number of rats第7 天Day 7第14 天Day 14模型對照組Control group 6 1.10 ±0.08 1.06 ±0.20 MEBO 組MEBO group 6 2.13 ±0.29a 3.30 ±0.57a VSD 組VSD group 6 1.49 ±0.23ab 2.04 ±0.29ab F 值F value 33.946 50.550 P 值P value ＜0.001 ＜0.001

4 討論

血管新生是創面愈合過程中的重要環節， 貫穿創面愈合全程［12］， 繼發性外周血管破壞和血管再生困難是導致糖尿病潰瘍創面難以愈合的關鍵［13－14］。 相關研究顯示， VEGF 可通過促使血管內皮通透性增加、 細胞外基質成分改變誘導新生血管的形成［15］。 MEBT／MEBO 的核心藥物MEBO 通過有效液化排除創面壞死組織、 激活創面潛能再生細胞、 促進肉芽組織中新生血管形成等作用在糖尿病潰瘍等創面愈合中取得了較好的臨床療效［16－18］。本研究筆者為進一步探究MEBO 在糖尿病潰瘍創面新生血管形成方面的作用機制， 觀察了MEBO 對大鼠糖尿病潰瘍創面愈合率及創面組織中MVD 與VEGF mRNA 表達水平的影響。

VEGF 是一種高度特異性的血管內皮生長因子，通過自分泌、 旁分泌、 胞內分泌等方式作用于血管內皮細胞受體， 促進血管內皮細胞生長、 細胞外基質降解、 血管管型結構形成； 還可通過提高血漿酶原活化因子的活性， 促使細胞外蛋白水解， 進而促進新生毛細血管形成［19－20］。 CD34 是高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白， 參與造血干細胞的運輸、 定植，其免疫組化檢測可作為血管生成的標志。 呂國忠等［21］的研究發現， VSD 可通過調控表皮生長因子受體、 VEGF 等因子的表達， 加速血管內皮細胞增殖、 分化以及創面血管網重建， 促進糖尿病潰瘍創面愈合。 劉明等［18］的研究顯示， MEBT／MEBO 可通過提高糖尿病潰瘍創面組織中VEGF 的表達， 促進創面血管新生及成熟， 提高糖尿病潰瘍創面的愈合能力。 本研究結果顯示， 干預第3、 7、 10、 14天， 模型對照組大鼠創面愈合率均明顯低于MEBO組與VSD 組， 且干預第14 天VSD 組大鼠創面愈合率又明顯低于MEBO 組； 干預第7、 14 天， 模型對照組大鼠創面組織中MVD 及VEGF mRNA 表達水平均明顯低于MEBO 組與VSD 組， 且VSD 組又明顯低于MEBO 組； 干預第14 天， 模型對照組、MEBO 組、 VSD 組大鼠創面組織中均可見大量密集分布的棕黃色顆粒， 且MEBO 組與VSD 組棕黃色顆粒量明顯多于模型對照組。 可見， MEBT／MEBO和VSD 均能明顯增加糖尿病潰瘍創面組織中VEGF mRNA 的表達水平， 促進糖尿病潰瘍創面組織中微血管的生成， 進而促進創面愈合， 且MEBT／MEBO的效果更加明顯。 其原因可能與MEBT／MEBO 在糖尿病潰瘍創面愈合后期的促血管生成能力較VSD更強［22－23］有關。

綜上所述， MEBT／MEBO 可通過提高VEGF mRNA 的表達水平促進血管生成， 進而促進糖尿病潰瘍創面愈合， 效果明顯優于凡士林油紗與VSD。但本研究樣本量較小， 結果可能存在偏倚， 且研究時間較短， 糖尿病潰瘍創面未能全部愈合， 還需擴大樣本量進行驗證。