襄陽市主要花生種植區土壤中黃曲霉菌分布及產毒力研究

張姝娟，王雪，褚乾梅，張奇，張倩，董菁，王盾*，馮鵬*

（1.襄陽市農業科學院，湖北 襄陽，441057；2.中國農業科學院油料作物研究所，湖北 武漢，430062；3.農業農村部生物毒素檢測重點實驗室，湖北 武漢，430062；4.農業農村部油料產品質量安全風險評估實驗室（武漢），湖北 武漢，430062）

花生營養價值高，約含50%的脂肪、25%的蛋白質和16%的碳水化合物，是蛋白質和熱量的優質來源，還含有人體必需的氨基酸[1]，根據花生品種的特性可以鮮食、熟食和榨油，屬于襄陽地區主要的經濟作物之一。然而花生在種植、收獲、儲藏和加工過程中極易受黃曲霉毒素污染，國內及國際對我國花生及其制品黃曲霉毒素超標現象時有報道。

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉（Aspergillus flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）、集峰曲霉（A.nomius）等曲霉屬真菌產生的次級代謝產物[2]，具有劇毒性、致突變性、強致癌性，主要作用于人和動物的肝臟組織，長期暴露在黃曲霉毒素中能夠誘導原發性肝癌；近年來一些研究表明黃曲霉毒素也會引起胰腺、腎臟、膀胱等器官癌變，還可能導致營養代謝不良、免疫抑制等病變[3,4]。黃曲霉菌的產毒能力由于菌株的不同而存在差異，根據各類研究目前已發現超過20種不同的黃曲霉毒素，天然產生的黃曲霉毒素類型主要有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2等4 種[5]，黃曲霉毒素B1被認為是目前毒性最大、致癌力最強的真菌毒素，1993年被世界衛生組織（WHO）的國際癌癥研究機構（IARC）劃定為Ⅰ類致癌物[6]。

花生具有地上開花、地下結果特性，花生生長期間，其莢果直接與土壤接觸，有研究證實土壤是花生黃曲霉菌的主要來源，花生中的黃曲霉與土壤中黃曲霉有直接的聯系[7]。因此，開展黃曲霉菌分布、產毒力及黃曲霉毒素污染研究，可為有效預防和控制產后花生黃曲霉毒素污染提供重要的理論依據。

目前，在已有的關于土壤中黃曲霉菌分布及產毒特征方面的研究中，Khan 等[8]認為土壤是農作物被黃曲霉毒素侵染的主要來源；Tran-Dinh 等[9]在針對越南土壤中黃曲霉菌的研究顯示，土壤樣品中分離出的黃曲霉菌均來自于農墾土地，且主要產生B族黃曲霉毒素；張初曙[10]對我國東南沿海、長江流域、黃河流域和東北地區共四個生態區同時也是國內主要花生產區的研究和張杏[11]全國11 個花生種植地的分析均表明長江流域土壤中黃曲霉菌分布最多，污染風險最大。襄陽，位于長江中游，地處南北交界區域，光照足、積溫多、降水均勻，獨特的地理環境及氣候適合花生的規?；N植，是長江流域主要的花生產區和集散地，隨著花生種植面積的逐年增長，現已形成棗陽、襄州、宜城、谷城等規?；a區，總種植面積接近6.67 萬公頃，單產4500 kg/hm2左右，高于全省平均水平，是湖北省第一大花生生產區和集散地。然而，現有的針對我國花生黃曲霉菌研究報道中，襄陽雖多次被列入調查對象[10～12]，但其調查范圍和取樣數量有限，代表性不足，不能較全面地反映襄陽花生產區的特征，要摸清襄陽地區花生種植區域土壤黃曲霉菌的分布情況，還需更詳細的調查研究。因此，本文立足于襄陽地區氣候特點，挑選典型種植區域，對花生土壤進行采樣和黃曲霉菌分離鑒定、產毒力測定，分析襄陽四個代表性花生產區黃曲霉菌分布和產毒特征，并與南北方調查數據進行比對，可為襄陽市花生黃曲霉毒素污染預警和防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養基與試劑 培養基：DG-18 瓊脂培養基，AFPA（曲霉瓊脂）培養基，液體沙氏培養基，均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

標準品：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準品購自北京壇墨質檢科技有限公司。

試劑：色譜級甲醇（美國Fisher公司），吐溫80。

1.1.2 儀器 電子分析天平，電子顯微鏡，錐形瓶、試管、燒杯，純水機（優普UPH-III），恒溫搖床，霉菌培養箱，液相色譜儀（島津LC-20AT）。

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品采集與處理 選取襄陽市轄區內四個花生主要產區（襄州、棗陽、宜城、谷城）所轄鄉鎮作為采樣點，根據襄陽市花生種植實際分布情況在4 個主產區選取共計13 個鄉鎮作為采樣點，在每個采樣點的花生田地采用五點取樣法取樣，5 個子樣混成一個樣品，每個采樣點至少采集樣品3份，共采集收獲期花生土壤樣品36 份。其中襄州區14份，棗陽9份，宜城7份，谷城6份。采樣方法參考朱婷婷等[12]，樣品低溫運回實驗室后放于4°C 冰箱內保存備用。土壤樣品研磨后直接用于黃曲霉菌分離純化。

1.2.2 黃曲霉菌的分離與純化 稱取磨碎后的10.0 g 土壤樣品加入90 mL 滅菌水中，用恒溫搖床充分混勻5 min，制成樣品基礎液，樣品基礎液稀釋度為10-1。取1 mL 樣品基礎液加入9 mL 無菌水中，制備出10-2稀釋度的土壤菌懸浮液，再取25 μL 該土壤菌懸浮液加在倒有DG-18 培養基的平板上，用涂布棒涂布均勻，每份樣品設2 個生物學重復。將接種好樣品的平板置于恒溫培養箱中，28±1℃黑暗培養5 d。5 d 后，從DG-18 培養基上挑取長有黃綠色孢子的菌落，接種到已倒好AFPA 培養基的平板上，于28±1℃條件下純化培養3～5d，直至長出單個菌落，將AFPA 培養基背面呈亮橘色的菌株初步鑒定為黃曲霉菌，然后從AFPA 培養基上挑取少許亮橘色菌絲于DG18 培養基上，28℃黑暗培養5 d 直至得到黃綠色孢子，將菌株孢子用0.1%的吐溫80 水溶液沖洗下來，作為菌種存于-18℃冰柜中備用。

1.2.3 黃曲霉菌鑒定 挑取單個菌落的菌株于AFPA培養基上，28℃培養3 d后進行觀察，然后挑選AFPA 培養基背面為橘黃色透明的菌株，寄北京擎科測序公司（武漢）進行ITS鑒定。

根據北京擎科測序公司（武漢）提供的測序結果報告所述，送檢的樣品經粗提出基因組DNA 后，選擇相應引物擴增特異片段并測序比對。PCR 擴增采用通用引物ITS1 和ITS4 擴增菌株ITS 序列，其中ITS1 序列為TCCGTAGGT-GAACCTGCGG，ITS4序列為TCCTCCCGCTTATT-GATATGC。

1.2.4 黃曲霉菌產毒培養 將保存的黃曲霉菌接種于DG18 培養基28℃培養5 d 后，用含0.1%的吐溫80無菌水將孢子從培養基上沖洗下來，制備黃曲霉菌分生孢子懸浮液備用。將制備好的黃曲霉分生孢子液置于電子顯微鏡下用血球計數板計數，然后吸取一定量的孢子懸浮液加入裝有30 mL沙氏液體培養基的錐形瓶中，使其最終濃度1.0×105個/mL。在28℃、200 r/min恒溫搖床培養7 d。

用滅菌紗布過濾產毒培養液于15 mL離心管中備用。取1 mL 產毒培養液再加4 mL 純水定量至5 mL，通過免疫親和柱，控制流速為2～3 mL/min，用10mL 水分2 次洗脫，洗脫完后將洗脫液棄去，用洗耳球將水吹盡，再加1 mL純甲醇洗脫，收集洗脫液，待液相上機。

1.2.5 產毒培養液中黃曲霉毒素的測定 將購買的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標準溶液用甲醇稀釋制備成濃度分別為5、10、50、100、200、500μg/L共6個梯度的混合標準溶液。

采用高效液相色譜串聯柱后光化學衍生法測定黃曲霉菌株產毒能力。

色譜條件：色譜柱為C18（5 μm，4.6 mm×150 mm）；柱溫為35℃；流動相為甲醇：水（V：V=45：55）；流速為0.9 mL/min；

檢測條件：光化學衍生器254nm；以熒光檢測器檢測，激發波長360 nm，發射波長440 nm，進樣量10μL。

1.2.6 計算方法 計算公式參考張杏等[11]文獻中的計算方法。

每克土壤中黃曲霉的菌落數（cfu/g）=平板的菌落數/0.025/稀釋倍數 （1）

每克土壤產生黃曲霉毒素（AFT）的量=每克土壤中黃曲霉菌落數×黃曲霉菌平均產AFT的量（2）

本文中計算每克土壤產生的黃曲霉毒素的量時所用的黃曲霉菌平均產AFT 的量是按照文中1.2.4 所述方法培養黃曲霉菌株后測得的培養液中毒素含量。計算公式（1）中0.025 為平板培養時加稀釋液體積。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉菌的分離與鑒定

采用稀釋涂布方法，對采自襄州、棗陽、宜城、谷城共36 份土壤樣品中的黃曲霉菌進行分離、純化，根據AFPA 培養基呈現亮橘色這一表征，初步篩選得到116株可產生黃綠色孢子的菌株。

2.2 黃曲霉的分子生物學鑒定

將AFPA 培養基背面為橘黃色透明的菌株培養單菌落平板后寄往第三方檢測機構（北京擎科測序公司（武漢）），用ITS 通用引物測序進行分子生物學鑒定，得到黃曲霉菌株99株，與數據庫中黃曲霉ITS序列相似性達到99%～100%（圖1）。

圖1 PCR擴增鑒定膠圖Fig.1 PCR electrophoretic results

2.3 襄陽市典型花生種植區土壤中黃曲霉菌分布

襄陽4 個花生代表產區共取樣36 份，檢出陽性樣品31 份，分離黃曲霉菌株共99 株，花生土壤中黃曲霉菌整體檢出率高達86.1%，說明襄陽花生種植區土壤中黃曲霉菌分布廣泛（圖2）。全市花生主產區的平均黃曲霉菌落數為5997.6 cfu/g，不同的花生種植區土壤中黃曲霉菌落數存在顯著差異，由表1可看出，襄州區花生土壤中黃曲霉菌落數最高，其范圍為0～24 000 cfu/g，平均值為9508 cfu/g；其次為棗陽，土壤中黃曲霉菌落數范圍為0～20 000 cfu/g，平均值5289 cfu/g；再次是宜城，菌落數范圍為400～16 000 cfu/g，平均值為3886 cfu/g；最低的是谷城，菌落數范圍為400～6400 cfu/g，平均值為1333 cfu/g。

表1 襄陽主要花生產區土壤中黃曲霉菌的分布Table 1 Distribution of Aspergillus flavus in peanuts planting areas in Xiangyang

圖2 襄陽代表性花生產區土壤取樣點分布示意圖Fig.2 Distribution of sampling areas and quantities of soils in Xiangyang

2.4 黃曲霉毒素標準曲線

在所選用色譜條件下，黃曲霉毒素得到良好的基線分離，4 種毒素在20 min 內出峰，先后順序為AFG2、AFG1、AFB2、AFB1，圖3 為黃曲霉毒素標準品色譜圖。以黃曲霉毒素的色譜峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度（X，μg/L）為橫坐標，繪制AFG2、AFG1、AFB2、AFB1標準曲線，得到線性回歸方程（表2），R2均大于0.999，說明線性關系良好。

圖3 黃曲霉毒素混合標準品色譜圖（標準品濃度均為10 μg/L）Fig.3 HPLC chromatogram of aflatoxin standard sample（sample concentration is 10μg/L）

表2 黃曲霉毒素混合標準品線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of aflatoxin standard sample

2.5 襄陽花生種植區土壤中黃曲霉菌產毒特征

對分離鑒定的99 株黃曲霉菌進行產毒特征分析，結果發現，能產生黃曲霉毒素的菌株所占的比例為63.6%，不產毒菌占36.4%。再對能產生黃曲霉毒素的菌株細分，根據菌株產毒種類可分為7 種類型（圖4）：只產AFB1的黃曲霉菌和只產AFG2的黃曲霉菌，占比分別為12.7%和1.6%；產生AFB1和AFB2兩種類型的黃曲霉菌，和AFB2和AFG2兩種類型的黃曲霉菌，分別占比22.2%和4.8%；產AFB1、AFB2和AFG2三種類型的黃曲霉菌、產AFB1、AFB2和AFG1三種類型的黃曲霉，占比分別為54.0%和1.1%；同時產AFB1、AFB2、AFG1和AFG2四種類型黃曲霉菌，占比1.6%。各個種植區的土壤黃曲霉菌株均以產生AFB1、AFB2和AFG2三種類型的毒素為主。

圖4 襄陽主要花生產區土壤中黃曲霉菌產毒類型分布Fig.4 Distribution of aflatoxin-producing types of A.flavus in soils of typical peanuts planting areas in Xiangyang

根據菌株毒素含量AFT（B1、B2、G1、G2四種類型毒素量總和），同時參考其它相關文獻[10,11]的劃分情況，將其產毒能力劃分為4個水平，并根據菌株產毒量分別命名為高產毒菌（＞1000 μg/L）、中產毒菌（100～1000 μg/L）、低產毒菌（0～100 μg/L）和不產毒菌（ND）。從圖5 中可以看出，襄陽市的花生種植區中分離出的黃曲霉菌株均以產AFT 量0～100 μg/L范圍的菌株（低產毒菌株）所占的比例最高，為38.4%，其次為不產毒菌株，占全部菌株比例為36.4%，高產毒菌占比最低，僅有5.1%。此結論與楊博磊[13]、張杏[11]等調查研究趨勢相同，說明襄陽花生主產區同長江流域其它產區一樣，土壤黃曲霉菌均以低產毒菌和不產毒菌為主。

圖5 襄陽主要花生產區土壤中黃曲霉菌產毒力分布Fig.5 Distribution of aflatoxin production by A.flavus in soils of main peanuts fields in Xiangyang

從表3 和圖6 中可以看出，所鑒定的樣品中宜城產區的不產毒菌占比為64.7%，明顯高于其它產區；低產毒菌在谷城和襄州產區占比均為最高的，分別為50.0%和41.8%；而棗陽產區分離出的黃曲霉菌株中中產毒菌占多數，為53.8%；棗陽和谷城產區未檢測到高產毒菌株，考慮到棗陽和谷城產區分離出的黃曲霉菌株較少，因此不能直接斷定這兩個產區沒有高產毒菌株的存在。

表3 襄陽主要花生產區土壤黃曲霉菌產毒力分布Table 3 Distribution of aflatoxin production by A.flavus in soils of main peanuts fields in Xiangyang

圖6 四個花生產區土壤中黃曲霉產毒力分布圖Fig.6 Distribution of aflatoxin production by A.flavus in soils of 4 peanuts fields in Xiangyang

經過進一步分析發現，襄陽地區的花生土壤中黃曲霉菌株產毒以B 族毒素為主，尤其是AFB1，平均產毒量是AFB1＞AFB2＞AFG2＞AFG1。對土壤中菌株產黃曲霉毒素AFT 含量比較分析發現，最高的為襄州，菌株平均產生黃曲霉毒素AFT 的量為218.7 μg/L，其次為宜城（173.2 μg/L），再次為棗陽（140.5μg/L），最低為谷城（16.1μg/L）；每克土壤中黃曲霉菌產AFT 的量也是襄州產區最高，為2080.0×103μg/L，其次為棗陽，每克土壤中黃曲霉菌產AFT 的量為742.89×103μg/L，最低的為谷城，每克土壤中黃曲霉菌產AFT 的量為20.4×103μg/L。

3 討論與結論

黃曲霉菌廣泛分布在緯度26～35℃的溫暖地帶，適宜生長溫度范圍為25～42℃，適宜水分活度（water activity，aw）為0.86～0.96，最適產毒溫度為28℃[14]。研究表明，環境溫濕度對黃曲霉菌的生長有明顯影響作用，高溫和潮濕的環境能促進黃曲霉菌的生長。襄陽地處漢江流域，水系豐沛，在花生生育期正處于夏季，具備典型的高溫和潮濕的環境，因此研究本地土壤中的黃曲霉菌分布及黃曲霉毒素污染狀況對花生生產具有重要意義。

通過本研究調查分析結果可以看出，在襄州的花生種植區土壤樣品中分離鑒定出的黃曲霉菌落數平均值為9508 cfu/g，遠高于其它幾個花生種植區，對比張初曙[10]2013 年的研究中展現的襄州（菌落數范圍0～16665 cfu/g，平均值為2749.3 cfu/g）和宜城（菌落數范圍0～1000 cfu/g，平均值297.5 cfu/g）的數據來看，也是襄州的黃曲霉菌落數遠高于宜城（表1）。與其它相關文獻中的數據對比可以發現，襄陽市主要花生種植區的黃曲霉菌落數整體平均水平為5997.6 cfu/g，遠高于張初曙[10]、張杏[11]、朱婷婷[15]等論文中所選取的襄陽花生種植區的土壤黃曲霉菌落數，原因可能是這些調查中所選取的取樣點范圍以及取樣數量不同。張初曙[10]在調查中是將襄州和宜城設置為長江流域代表采樣地，在這兩個采樣地方圓一公里內進行多點采樣；朱婷婷選擇襄陽產區十個村進行取樣調查；而近五年來襄陽的花生種植面積增加了50%以上，本次調查研究取樣的范圍覆蓋襄州產區和宜城產區共計7 個村鎮采樣地，全面覆蓋了襄州和宜城主要的花生種植地域，同時還增加了之前調查中未涉及的谷城和棗陽等花生種植區域，取樣點涵蓋了襄陽地區四個縣市區共計13 個村鎮的種植基地，可以較全面的展現出襄陽本地黃曲霉菌的分布特點。

張初曙的調查[10]覆蓋了東北地區（河北、遼寧、山東等）、黃河流域（山東?。?、長江流域（湖北?。?、東南沿海（廣東?。讉€產區，其中遼寧沈陽、山東青島、湖北黃岡、廣東湛江土壤中黃曲霉菌落范圍分別為0～33.3 cfu/g、0～300 cfu/g、33.3～6660 cfu/g、0～1666.7 cfu/g；張杏等[16]調查西南主產?。ㄋ拇ㄅ畎?、云南廣南、西藏察隅等）花生土壤中黃曲霉菌落數，得到菌落數平均范圍分別為100～223 cfu/g；在朱婷婷論文[15]中展示黑龍江齊齊哈爾、河南開封、江蘇連云港、安徽合肥、廣東湛江等地土壤中黃曲霉菌落數平均值分別為10 cfu/g、160 cfu/g、170 cfu/g、240 cfu/g、50 cfu/g；楊博磊等[13]調查了四川南充、河北保定等地的花生土壤黃曲霉菌落數據分別為194 cfu/g、25 cfu/g；劉付香等[17]在對廣東省廣州市等10 個地市花生田黃曲霉數量的調查中得到其平均菌落數范圍在20～160 cfu/g。綜合以上數據可以看出，襄陽市花生主產區的黃曲霉菌落數平均值相較于其它產區都要顯著偏高，分析原因，可能是因為襄陽市地處長江中下游，位于我國地勢第二階梯向第三階梯過渡地段，區域內地勢自西北向東南傾斜，可分為西部山地、中部崗地平原及東部低山丘陵三個地形區，氣候總體屬于亞熱帶季風氣候向北方溫帶季風氣候過渡，雨熱同期[18]，每年夏花生播種到收獲時期為6 至9 月，此段時間一般雨水較多且溫度高，降水分布趨勢是自東南向西北遞減，種植區土壤也多以保水性較好的黏土為主，為黃曲霉菌生長創造了有利條件。對比襄陽市四個花生產區的數據也呈現該種趨勢，黃曲霉菌落數最高的襄州區地勢較其它地區更平坦，且均為黏土，而谷城縣多山，土壤也多為砂土。由此可以看出，在襄陽市花生主產區中，襄州區的土壤中黃曲霉菌分布最廣且菌落數最高，其種植花生過程中的風險也更大，在后期花生被黃曲霉菌侵染的幾率也更大。

根據產毒力試驗顯示，襄陽市花生種植區所分離的黃曲霉菌株以低產毒菌占比最高、不產毒菌次之，這與朱婷婷等調查研究的結論相同。張初曙[10]針對全國主要花生產區的調查研究得出長江流域種植區的土壤黃曲霉菌中高產毒菌占比為10.2%，為全國幾個主要產區中最低的，東南沿海高產毒菌占比最高為55.4%，本次調查分析的數據也顯示襄陽花生主產區高產毒菌占比為5.4%，遠低于其它調查文獻[10,15]中東北產區和東南產區分離出的高產毒菌占比，說明襄陽花生產區雖然土壤中黃曲霉菌含量較高，但多為不產毒菌株和低產毒菌株。值得注意的是，本次調查研究結果顯示分離出高產毒菌株的兩個產區（襄州和宜城）中，高產毒菌株和不產毒菌株的比例呈現負相關性，可以推測花生土壤中不產毒菌株可以抑制高產毒菌的生長。

襄陽花生主要產區的黃曲霉菌株產毒量平均為137.1 μg/L，各個產區的菌株平均產AFT 的量和AFB1的量十分相近，說明襄陽產區土壤黃曲霉菌以產生毒性較強的B1型毒素為主，花生被黃曲霉毒素污染后產生的危害較大（表4）。但對比文獻中其它地區黃曲霉菌株產毒力的數據，張初曙[10]的調查結果是長江流域菌株平均產毒量為1566μg/L、東南沿海為5836μg/L、黃河流域為5453μg/L、東北地區為1886μg/L，張杏等[16]調查的西南產區菌株平均產毒量范圍為2135～6807.5 μg/L，襄陽花生主產區的黃曲霉菌株產毒量較低。張初曙[10]調查襄陽市襄州產區的土壤黃曲霉菌株產AFB1的量為147μg/L，本調查中相應結果為202.7 μg/L，因為取樣地點覆蓋面不同，襄州區面積2306平方公里，張初曙[5]調查時襄州區作為一個采樣地在一公里范圍內取樣，本次取樣是在襄州區4 個村鎮的花生種植地，取樣村鎮覆蓋面積的增加可能會導致樣品中分離出高產毒菌的占比更大。

表4 襄陽花生主產區土壤黃曲霉菌株產毒能力Table 4 Ability of aflatoxin production by A.flavus in peanuts fields in Xiangyang

本研究發現，襄陽市花生代表性產區土壤中黃曲霉的分布數量顯著高于我國南、北方花生主產區的平均水平，但其菌株的平均產毒能力卻遠低于全國其它地區。這表明在襄陽市獨特的自然地理條件下，大量的不產毒菌和低產毒菌對高產毒菌的生長可能存在一種自然抑制機制[19]。襄陽市花生主要產區中襄州地區土壤中黃曲霉菌分布最多且產毒能力最強，因此在生產過程中應注意土壤的排水措施，并且通過施加生物菌肥等方式降低花生被土壤中黃曲霉菌侵染的幾率，通過宜城產區不產毒菌和高產毒菌極顯著的負相關性可以考慮投放不產毒黃曲霉素菌作為生防菌，與高產毒菌形成競爭生態位，從而降低花生黃曲霉毒素污染的風險[8]。

黃曲霉的田間污染被認為是花生黃曲霉菌侵染和產毒的重要源頭，控制花生收獲前土壤中黃曲霉菌的生長和產毒是降低花生黃曲霉毒素污染的重要途徑。因此，摸清土壤中黃曲霉菌的分布情況和產毒力特征是開展襄陽花生黃曲霉污染產前防控的前提和基礎。本研究下一步將繼續探索襄陽花生產區土壤中黃曲霉菌群產毒力與土壤類型之間的關系，以及土壤黃曲霉菌群分布對花生產前、產后黃曲霉侵染風險之間的關系，為襄陽花生產區黃曲霉毒素污染預警和防控措施制定提供理論依據。