環狀RNA hsa_circ_0009244對食管鱗癌細胞生物學行為的影響

張 嵐，朱 迪,2，姜國忠 (.鄭州大學第一附屬醫院病理科，河南 鄭州 450052；2. 鄭州大學第五附屬醫院病理科，河南 鄭州 450052)

我國是食管癌發病率最高的國家之一，食管鱗癌約占總確診病例的90%[1-2]。食管鱗癌作為高侵襲性惡性腫瘤，其疾病進展迅速，患者預后較差，5 a總體生存率較低，Ⅳ期患者的中位生存期不足1 a，大多數食管鱗癌患者早期不易發現，初次確診時已處于中晚期階段[3-5]。近年來，雖然在食管鱗癌的診斷和治療方面取得了突破性進展，但其患者的生存率并沒有顯著提高[5-6]。因此，更好了解食管鱗癌發生的分子機制，識別新的生物標志物和治療靶點，對于提高食管鱗癌的早期診斷和治療水平顯得尤為重要。

人類基因組研究項目的結果已經證實，有超過70%的人類基因組可轉錄為RNA，但大多數是非編碼RNA，環狀RNA(circular RNA，circRNA)作為一類新的內源性非編碼RNA，是通過反向剪接方式產生的共價閉合環狀結構，缺乏5’帽結構和3’多聚腺苷酸尾，具有結構穩定性和進化保守性等特點，對多種疾病的發生發展過程均有影響[7-8]。研究[9]發現，微小RNA(micro RNA，miR)是一類長約22個寡核苷酸的非編碼小RNA，通過轉錄后調控機制參與靶基因的調控，而circRNA可作為miR分子海綿以發揮其調控作用。研究[10-15]證實circRNA在多種腫瘤的發生、發展中起著重要作用，具有作為腫瘤標志物的可能性。同樣，對circRNA全方位、多層面的研究將有助于我們對食管鱗癌的深入了解，并對食管鱗癌的早期診斷及其靶向治療提供新思路。

課題組前期已對所提取的73對食管鱗癌腫瘤組織及其癌旁正常組織的總RNA測序結果進行分析，發現circRNA的表達在食管鱗癌組織中存在顯著差異性，hsa_circ_0009244(circ-9244)便是其中之一[5]。因此，本研究通過對食管鱗癌腫瘤組織及癌旁正常組織中circ-9244的表達水平進行分析，發現circ-9244在食管鱗癌組織中呈高表達水平，且與食管鱗癌患者預后不良有關，并進一步探討下調circ-9244的表達水平對食管鱗癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞、臨床標本及主要試劑

1.1.1 細胞 食管鱗癌細胞系及正常食管上皮細胞Het-1A均購自上海中科院細胞庫。

1.1.2 臨床標本 來自安陽市腫瘤醫院食管鱗癌患者的手術切除標本，標本均在術中快速液氮凍存。本研究中入組的所有患者均簽署了知情同意書，并在術前沒有進行任何放療、化療和靶向治療。

1.1.3 主要試劑 胎牛血清購自以色列BI公司；DMEM高糖培養基購自美國 Hyclone公司；質量分數0.25% EDTA胰蛋白酶消化液購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine?2000購自美國Invitrogen公司；T4-DNA連接酶及EcoRI-HF/AgeI-HF內切酶均購自中國NEB公司；PLKO.1-TRC克隆載體購自廣州吉賽生物科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR)試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；無內毒素質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司、MTS試劑購自北京普瑞金科技有限公司；Transwell小室及Matrigel基質膠均購自美國Corning公司；實驗用引物均有北京擎科生物技術有限公司鄭州分公司合成。

1.2 方法

1.2.1 質粒構建 根據Circular RNA Interactome網站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)設計circ-9244的siRNA序列，并依據addgene網站(https://www.addgene.org/protocols/plko/)中PLKO.1-TRC克隆載體的要求設計目的基因circ-9244的短發夾RNA(short hairpin RNA ，shRNA)序列(表1)。其shRNA設計原則如下：正向引物：5’CCGG--21 bp sense--CTCGAG--21 bp antisense--TTTTTG 3’；反向引物：5’AATTCAAAAA--21 bp sense--CTCGAG--21 bp antisense 3’；各取5 μL正反引物(20 μm)，退火形成發夾結構；用AgeI-HF和EcoRI-HF對PLKO.1-TRC克隆載體進行37 ℃過夜雙酶切；用T4-DNA 連接酶將線性化載體和 shRNA 目的片段按照1：10比例16 ℃過夜連接；按 1：10 比例將連接產物轉移至DH5α感受態細胞中進行轉化并置于37 ℃細菌培養箱中過夜孵育；挑取單菌落進行菌液鑒定并送至北京擎科生物技術有限公司進行測序；根據測序結果，對構建成功的PLKO.1-circ-9244-shRNA質粒進行提取和保存。

表1 circ-9244-shRNA序列

1.2.2 細胞培養 從液氮罐中取出凍存的細胞株KYSE410、KYSE520，37 ℃水浴鍋中迅速解凍后將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，加入3 mL完全培養基，巴氏管輕吹混勻后1 000 r/min離心3 min；棄上清并加入3 mL完全培養基，巴氏管輕吹混勻后均勻鋪至細胞培養皿中，放于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中進行細胞培養。運用牛鮑計數板對細胞進行計數和鋪板，12孔板細胞密度以每孔細胞數1×105個為宜，37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中過夜培養；次日按照轉染試劑與待轉染質粒2：1比例進行細胞轉染；48 h后進行后續實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測circ-9244表達水平及shRNA下敲效果 分別對食管鱗癌細胞、正常食管上皮細胞、轉染48 h的空載組和實驗組細胞進行RNA提取并逆轉錄為cDNA，并將cDNA原液用雙蒸水稀釋到100 ng/μL。選取上游引物circ-9244-F：AGGCTCAACGAGGAACTCAA、下游引物circ-9244-R：GTCCTGGCTCCATCCAAT；上游引物GAPDH-F：ACCCAGAAGACTGTGGATGG、下游引物GAPDH-R：TTCAGCTCAGGGATGACCTT。根據說明書配置qRT-PCR反應體系，設定反應條件，每個指標做3個復孔。最后進行數據分析，篩選出下敲效率較高的PLKO.1-circ-9244-shRNA 質粒。

1.2.4 MTS實驗 按照實驗分組對轉染48 h的細胞進行計數，空載組為僅轉染空載質粒48 h且不涉及 circ-9244 表達量改變的細胞組，實驗組為轉染下敲質粒48 h且與circ-9244表達量改變相關的細胞組。按照每孔5 000個細胞、100 μL培養基的標準，每個指標設置6個復孔，共測6個時間點：0、12、24、36、48和60 h，計算各個實驗組所需細胞懸液量和需補加的完全培養基的量依次鋪于96孔板中，37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱孵育6～8 h。然后按照完全培養基與MTS試劑10：1的比例配制反應體系，避光輕吹混勻，棄去0 h組中舊培養基，并依次取110 μL的MTS溶液加到各個孔中，細胞培養箱中孵育1～2 h后，輕拍混勻，酶標儀上測492 nm處的光密度(optical deasity,OD)值，作為0 h數據；每隔12 h測下一個時間點的OD值，直至6個時間點測完為止，將數據保存并對實驗結果進行統計分析。

1.2.5 劃痕實驗 按照實驗分組對轉染48 h的細胞進行計數(分組同上)，以每孔1×105個細胞的標準鋪于12孔板中，每個指標做3個復孔，37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中過夜培養。在12孔板中央均勻劃線，并清洗脫落的細胞，在顯微鏡下拍照保存，作為0 h劃痕結果。每隔24 h進行拍照，依次拍攝24、48 h劃痕結果，并對數據進行整理與分析。

1.2.6 Transwell實驗 首先對Transwell小室(含matrigel膠)進行水化處理并按照實驗分組對轉染48 h、進行饑餓處理的細胞進行計數，空載組為轉染空載質粒48 h、進行饑餓處理12 h且不涉及circ-9244表達量改變的細胞組，實驗組為轉染下敲質粒48 h、進行饑餓處理12 h并與circ-9244表達量改變相關的細胞組；以每小室5×104個細胞的標準接種于各個Transwell小室中，并在下室加入600 μL含體積分數20%胎牛血清的完全培養基，每個指標各做3個復孔，37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱中培養48 h。甲醇固定30 min，并用質量分數0.2%結晶紫室溫染色0.5～1 h。顯微鏡下拍照保存，并對結果進行統計分析。

2 結果

2.1 circ-9244在不同食管組織中的表達及其與食管鱗癌患者預后的關系隨機選取前期研究的55對食管鱗癌組織分析circ-9244表達水平，發現與癌旁正常組織相比，其表達水平在腫瘤組織中升高約3.8倍(t=2.862，P=0.005)；并根據circ-9244相對表達量分組進行食管鱗癌患者預后分析發現，與circ-9244低表達組比較，circ-9244高表達組患者預后較差(P=0.038)。見圖1、2。

圖1 circ-9244在不同食管組織中表達比較

2.2 circ-9244不同食管細胞中的表達circ-9244在KYSE270、KYSE410及KYSE520細胞中表達相對較高。見圖3。

圖2 不同circ-9244表達食管鱗癌患者生存曲線比較

圖3 circ-9244在不同食管細胞中的表達

2.3 PLKO.1-circ-9244-shRNA質粒下敲效率的鑒定選取circ-9244相對高表達的KYSE410和KYSE520細胞，分別轉染PLKO.1-NC-shRNA質粒(空載組)和PLKO.1-circ-9244-shRNA質粒(實驗組)，以篩選具有較高下敲效率的質粒進行后續實驗，結果發現，與空載組比較，實驗組PLKO.1-circ-9244-shRNA2質?？擅黠@下調circ-9244的表達水平(KYSE410細胞：t=3.013，P=0.010； KYSE520細胞：t=5.959，P=0.004)。見圖4。

圖4 不同PLKO.1-circ-9244-shRNA質粒下敲效果的驗證

2.4 MTS實驗結果選取下敲效率高的PLKO.1-circ-9244-shRNA2質粒轉染上述circ-9244高表達KYSE410和KYSE520細胞，48 h后運用MTS法檢測細胞的增殖效率，結果表明，與空載組比較，實驗組食管鱗癌細胞增殖效率、劃痕愈合率及穿膜細胞數明顯低于空載組，差異均有統計學意義(KYSE410細胞：t=12.345，P<0.001；KYSE520細胞：t=7.941，P<0.001)。見圖5。

圖5 下調circ-9244表達對食管鱗癌細胞增殖的影響

2.5 劃痕實驗結果選取PLKO.1-circ-9244-shRNA2質粒轉染KYSE410和KYSE520細胞進行細胞劃痕實驗，結果表明，與空載組比較，實驗組敲低circ-9244表達后食管鱗癌細胞劃痕愈合率明顯低于空載組，差異均有統計學意義(KYSE410細胞：t=10.910，P<0.001；KYSE520細胞：t=8.499，P<0.001)。見圖6。

圖6 下調circ-9244表達對食管鱗癌細胞遷移能力的影響

2.6 Transwell實驗結果選取高下敲效率的PLKO.1-circ-9244-shRNA2質粒，轉染至circ-9244高表達KYSE410和KYSE52 細胞，48 h Transwell結果表明，與空載組比較，實驗組食管鱗癌穿膜細胞數明顯低于空載組，差異均有統計學意義(KYSE410細胞：t=11.040，P<0.001；KYSE520細胞：t=10.720，P<0.001)。見圖7。

圖7 下調circ-9244對食管鱗癌細胞侵襲能力的影響

3 討論

食管癌是具有高度侵襲性、高發病率和高致死率的消化道惡性腫瘤之一，食管鱗癌作為食管癌常見組織類型，大多數 食管鱗癌 患者都伴有晚期疾病，5 a生存率常低于20%，病死率較高[16]，這對人類的生命健康構成了嚴重的威脅。且該腫瘤早期不易發現，其浸潤和轉移是導致治療失敗和患者死亡的主要原因[17-18]。因此，早發現、早治療對提高食管鱗癌患者的生命質量顯得尤為重要。

CircRNA作為長鏈非編碼RNA的一個亞類，是通過反向剪接方式形成的一類新型核糖核酸分子，具有共價閉合的環狀結構，可以抵抗核酸外切酶的降解作用，是近年來研究的熱點。且近10 a的研究[19-20]已經表明circRNA以其獨特的生物學屬性和多樣的生物學功能對包括惡性腫瘤在內的多種疾病的發生、發展均具有重要的調節功能。如circRNA可以通過miR的 “海綿”吸附作用、親本基因的轉錄調節作用及競爭性結合RNA結合蛋白等作用發揮生物學功能[21-22]，且某些circRNA可以通過m6A甲基化修飾來促進翻譯[23]。

本研究前期對食管鱗癌腫瘤組織與癌旁配對組織中circRNA的表達譜進行分析，發現具有差異表達的circ-9244[16]。Circ-9244的宿主基因SDF4，又名 Cab45，通過選擇性剪接可以形成三種不同的亞型，屬于鈣離子結合蛋白超家族中的一員[24-26]，且相關研究發現Cab45 在Panc1胰腺癌細胞、結腸癌LIM1215細胞、宮頸癌HeLa細胞和食管癌細胞中表達均上調，并促進上述腫瘤細胞的增殖和遷移[27]。因此，我們猜想是否可以通過干擾circ-9244在食管鱗癌中的生物合成過程來降低其在食管鱗癌中的表達水平，從而達到抑制食管鱗癌惡性行為的進展。

本研究以前期實驗為基礎，進一步分析發現circ-9244在食管鱗癌腫瘤組織中呈高表達水平，且與患者預后不良有關。通過構建circ-9244下敲質粒并成功轉染至食管鱗癌細胞中，根據MTS實驗、劃痕實驗及Transwell實驗分別觀察空載組和實驗組細胞增殖、遷移和侵襲的數量，結果均表明下調circ-9244的表達水平可顯著抑制食管鱗癌細胞的生物學行為。由此推測抑制circ-9244的表達可以減弱食管鱗癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，從而阻止食管鱗癌的惡性進展。因此，circ-9244或可成為下一個食管鱗癌潛在的生物標志物和治療靶點。