聯合抑制FLT3和p65表達對THP-1細胞增殖和凋亡的影響

王春美，任艷嬌，盛光耀 (鄭州大學第一附屬醫院兒童醫院，河南 鄭州 450052)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是兒童常見的一種血液系統惡性腫瘤，因其較高的復發率及治療相關的死亡率，5 a無病存活率僅為40～50%左右[1-3]，伴有FMS樣酪氨酸激酶3-內部串聯重復(FMS-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication, FLT3-ITD)突變的患者預后更差[4-6]。雖然FLT3抑制劑索拉菲尼、舒尼替尼、吉瑞替尼已經廣泛應用于臨床，但因為藥物的安全性及耐藥性問題，部分患者不能使用上述藥物治療。同時對于腫瘤的治療，單個藥物的作用是有限的，臨床上多采取多種藥物聯合化療方案。我們前期研究證實，AML細胞株THP-1細胞中存在FLT3/p65/核輔抑制子維甲酸/甲狀腺受體沉默因子(silencing medtiator for retinoic acid and thyroid hormone receptor, SMRT)信號通路的異?；罨?，p65小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、FLT3 siRNA均可有效抑制THP-1細胞的增殖，并誘導細胞凋亡[7-8]。本研究擬在前期研究的基礎上，進一步探討聯合阻斷FLT3、p65對THP-1細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株THP-1細胞株購自上海中科院細胞庫，使用含體積分數10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素、0.05 mol/L 2-巰基乙醇的RPMI-1640培養基，置于37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養。

1.2 主要試劑FLT3 siRNA、p65 siRNA、control siRNA、鼠抗人FLT3單克隆抗體、鼠抗人核因子κB (nuclear factor κappa B, NF-κB)p65單克隆抗體和山羊抗人SMRT多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司，山羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)、兔抗山羊IgG-HRP和3,3’-二氨基聯苯胺(3,3’-Diaminobenzidine, DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，細胞總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，細胞計數試劑-8(cell counting kit-8, CCK-8)試劑盒和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.3 細胞增殖的檢測收集處于指數期生長的THP-1細胞，制成細胞懸液，在96孔板中接種細胞懸液(100 μL/孔)，100 μL含有4 000個細胞。設對照組(未轉染組)、NC-siRNA組(control siRNA轉染組)、FLT3 siRNA組、P65 siRNA組及FLT3 siRNA+p65 siRNA轉染組(聯合組)，每組設3復孔，分別于0、24、48、72、96、120、144、168 h取1塊培養板，每孔加10 μL CCK-8溶液，培養箱內孵育4 h，上酶標儀檢測450 nm波長處的吸光值(A450)。以時間為橫坐標、細胞密度為縱坐標，繪制細胞增殖曲線。

1.4 細胞凋亡的檢測本研究采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。具體步驟如下：按照siRNA轉染試劑盒的說明書的要求轉染細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，接種于6孔培養板中，分別將含有FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA和siRNA轉染試劑的混合液與細胞共孵育6 h，后更換正常血清和抗生素2倍的培養基，孵育18 h后更換為正常培養基，繼續培養48 h收獲細胞。1 000 r/min離心5 min，棄上清液，用1 mL預冷的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)重懸細胞，調細胞密度為2～5×105個/mL，取195 μL 細胞懸液至一個干凈無菌的試管中，并加入5 μL Annexin V-FITC，暗室中孵育10 min；室溫1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重懸細胞于190 μL的結合液中；加入5 μL的PI染色液，混勻后上流式細胞儀檢測。Annexin-V染色陽性、PI染色陰性的細胞早期凋亡細胞。

1.5 細胞周期的檢測離心收集FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA處理48 h的細胞，PBS洗滌后離心，棄上清，加入預冷的體積分數70%乙醇1 mL，4 ℃過夜孵育。次日再次離心、棄上清、重懸細胞，依次加入RNaseA(終濃度50 mg/L)、PI(100 mg/L)，室溫避光孵育30 min；上流式細胞儀檢測各周期的細胞。

1.6 實時熒光定量PCR(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測FLT3、p65和SMRT mRNA的表達根據基因庫中靶基因序列設計相應引物，β-actin基因作為內部參照。細胞總RNA提取試劑盒提取收獲的細胞總RNA，按照實驗操作說明反轉成cDNA第一鏈，然后取l μL cDNA、0.5 μL的FLT3、p65、SMRT及β-actin上下游引物進行PCR擴增30個循環，體積分數2%的瓊脂糖凝膠電泳分析各PCR產物。各目的基因mRNA相對含量(M)=目地基因吸收峰面積/β-actin吸收峰面積。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 Western blotting檢測p65和SMRT蛋白的表達離心收集FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA處理48 h的THP-1細胞，提取細胞總蛋白，-80 ℃冰箱凍存。Bradford法測定蛋白濃度。蛋白樣本經體積分數10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉至聚偏氟乙烯膜上，使用含體積分數5%脫脂奶粉的TBST溶液于4 ℃環境中封閉過夜。一抗(鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體，山羊抗人SMRT多克隆抗體，1：200稀釋)室溫孵育2 h，依次使用TBST溶液、TBS溶液洗滌，對應的二抗(1∶3 000稀釋)室溫孵育2 h，依次使用TBST溶液、TBS溶液洗滌，ECL發光液處理后暗室內曝光，膠片掃描后使用Image-Pro Plus 5.0軟件分析灰度值結果。

1.8 流式細胞術(flow cytometry, FCM)檢測FLT3蛋白的表達離心收集FLT3 siRNA、p65 siRNA、FLT3 siRNA+p65 siRNA處理48 h的THP-1細胞，分組同前，分別加入10 μL的FLT3抗體，室溫避光反應30 min；PBS洗滌后重懸細胞；每管加入10 μL山羊抗鼠IgG1-FITC二抗10 μL，混勻后避光反應30 min；PBS洗滌后重懸細胞，上流式細胞儀檢測FLT3蛋白的表達。

2 結果

2.1 THP-1細胞增殖曲線的比較FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯合組的細胞增殖明顯受抑制，增殖曲線低平，缺乏指數增殖的特征，以聯合組的細胞增殖曲線最為顯著；第6天后，當細胞密度≥1×106個/mL，對照組的死亡細胞數量增加，A450明顯下降。見圖1。

圖1 各組THP-1細胞增殖曲線比較

2.2 各組細胞凋亡的比較FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯合組處理THP-1細胞后，細胞的早期凋亡率分別為(11.05±3.87)%、(14.2±4.57)%和(21.29±4.74)%，較對照組[(1.36±1.03)%]及NC-siRNA組[(1.56±0.94)%]均顯著增加(F=22.311,P<0.001)，以聯合組最為明顯。

2.3 各組細胞周期的比較FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯合組處理THP-1細胞后，G0/G1期的細胞比例顯著增加(F=32.705,P<0.001)，S期的細胞比例顯著減少(F=42.611,P<0.001)，但G2/M期的細胞比例無明顯變化(F=0.967，P=0.467)，以聯合組的作用最為明顯，提示細胞出現G0/G1期至S期的阻滯。見表2。

表2 各組THP-1細胞周期比較 %

2.4 各組FLT3、p65和SMRT mRNA的表達FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯合組中FLT3 mRNA的表達明顯降低(F=22.311,P<0.001)，以聯合作用最為明顯；p65 siRNA及聯合組中p65 mRNA的表達明顯降低(F=88.911,P<0.001)；p65 siRNA及聯合組中SMRT mRNA的表達均明顯增高(F=7.736,P=0.005)。見表3。

表3 各組THP-1細胞中FLT3、p65和SMRT mRNA表達比較

2.5 各組FLT3、p65和SMRT蛋白的表達FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯合組中FLT3蛋白的表達明顯降低(F=128.78,P<0.001)，以聯合作用最為明顯；p65 siRNA及聯合組中p65蛋白的表達明顯下降(F=27.591,P<0.001)；p65 siRNA及聯合組中SMRT蛋白的表達均明顯增高(F=6.123,P=0.009)。見表4。

表4 各組THP-1細胞中FLT3、p65和SMRT蛋白表達比較

3 討論

AML的發生是涉及多基因參與、多步驟累及、多因素影響的復雜的過程[9]。近年來，隨著分子生物學技術的發展及基因檢測的開展，對AML分子機制的研究越來越深入，小分子靶向治療也納入了兒童AML的常規化療過程中[10]。目前已發現了200多種與AML發病有關的基因重排及基因突變，部分已明確與AML的不良預后有關[5,11]。目前針對不良預后基因的分子靶向治療是腫瘤研究的熱點，但是任何一種藥物的作用是有限的，多靶點聯合用藥阻斷腫瘤的發生發展才有可能是根治腫瘤的有效手段[12]

目前臨床上已研發出FLT3特異性抑制劑，包括第1代的索拉菲尼、舒尼替尼等，第2代的吉瑞替尼、奎扎替尼等，但是只作為常規治療的聯合用藥，提示FLT3抑制劑的抗腫瘤作用是有限的[13-15]。我們前期研究發現，FLT3和p65均可作為THP-1細胞FLT3/p65/SMRT信號通路中的分子靶標，分別抑制FLT3、p65表達均可有效抑制THP-1細胞增殖、阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，并可影響下游相關信號分子的表達。本研究在前期研究的基礎上，進一步探討了聯合抑制FLT3和p65表達對THP-1細胞的影響。結果發現，FLT3 siRNA、p65 siRNA及兩者聯合作用均可有效抑制THP-1細胞的增殖并誘導其凋亡，并導致細胞發生G0/G1期到S期的阻滯，聯合組的作用效果最為顯著，但并不是FLT3 siRNA、p65 siRNA單獨作用的簡單疊加，提示FLT3 siRNA、p65 siRNA可能通過某種未知機制存在的協同作用。

通過對FLT3/p65/SMRT信號通路中相關分子的研究還發現，FLT3 siRNA、p65 siRNA及聯合組中FLT3 mRNA和蛋白表達水平均顯著下降，以聯合組的結果最為明顯；p65 siRNA及聯合組中p65mRNA和蛋白表達明顯減少，但兩者間無顯著差異；p65 siRNA及聯合組中SMRT mRNA和蛋白的表達均明顯增高，2組間的表達無明顯差異；FLT3 siRNA組p65和SMRT mRNA和蛋白的表達無明顯變化，提示雖然聯合抑制FLT3和p65表達的作用更強，但FLT3/p65/SMRT信號轉導途徑并不是FLT3 siRNA、p65 siRNA影響THP-1細胞的唯一途徑，具體機制仍需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究在細胞水平證實了聯合抑制FLT3和p65表達治療AML的有效性，因此同時以FLT3和p65為分子靶點的靶向治療可作為AML治療策略的研究方向之一。