皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型的構建及評價*

李明哲，徐龍飛，2，陳照立，王新興，蒲玲玲，劉偉麗，王天輝△

（1.軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所，天津 300050；2.天津體育學院天津市運動生理與運動醫學重點實驗室，天津 301617）

應激及創傷性事件對多種疾病的發生發展影響巨大，常常作為疾病發病或惡性轉歸的重要誘因［1-3］。其中，以精神類疾病最為典型，常見的疾病包括抑郁癥、躁狂和創傷后應激障礙等，即便是遺傳背景主導的某些疾病如精神分裂癥、雙相情感障礙等也常常是遺傳基因和應激性事件共同作用的結果［4，5］。因此，應激反應的相關研究一直是醫學領域的研究重點。本研究目的是為細胞應激水平的評估和細胞應激損傷調控研究提供一種可行的實驗對象，構建一種應激激素誘導的細胞梯度應激損傷模型。相比于經典的應激激素誘導的細胞應激損傷模型，該模型通過調節應激激素的干預水平，模擬生物體系不同的應激損傷程度，構建一種梯度變化的應激損傷狀態，為應激損傷的檢測評估技術開發和應激基礎研究提供一種良好的、可行的實驗對象。

在機體發生應激反應時，可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA），并促進重要的應激激素——糖皮質激素（glucocorticoids，GC）大量分泌［6-8］。中樞神經系統作為應激損傷的重要靶點，比其他器官集中更高濃度的糖皮質激素受體，因此是對應激特別敏感、易受應激損傷的組織［8-10］。所以，神經細胞是構建應激損傷模型的良好選擇。PC12細胞是一種常用的神經細胞株。其來源于一種可移植的大鼠嗜鉻細胞瘤，該細胞對神經生長因子（nerve growth factor，NGF）有可逆的神經元顯形反應，該細胞不合成腎上腺素。其具有可傳代的特點，廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究［11］。因此可作為應激損傷細胞模型的實驗主體。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12，購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

高糖杜氏培養基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，貨號：L110KJ，BasalMedia）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered solution，PBS，貨號：P1020，Solarbio）、胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS，貨號：04-001-1ACS，BI，Israel）、青鏈霉素雙抗（貨號：SV30010，Cytiva，America）、胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25%），不含酚紅（貨號：T1300，Solarbio）、皮質酮（貨號：M5533，Abmole，America）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，貨號：D8372-500ml，Solarbio）、96孔平底細胞培養板（貨號：701001，NEST）、6孔細胞培養板（貨號：703001，NEST）、T25細胞培養瓶（貨號：707003，NEST）CCK-8試劑盒（Cell counting Kit-8，CCK-8，貨號：M4839，Abmole，America）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（貨號：A003-1，南京建成）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒（貨號：A001-1，南京建成）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020，Solarbio）、NAD（H）測定試劑盒（貨號：A114-1-1，南京建成）、乳酸脫氫酶檢測試劑盒（貨號：BC0685，Solarbio）、電子天平（型號：ARA1140，OHAUS，America）、臺式高速冷凍離心機（型號：TLL-C，北京四環科學）、超聲波細胞粉碎機（型號：SCIENTZ-ⅡD，寧波新芝生物科技有限公司）、酶標儀（型號：Multiskan MK3，Thermo，Germany），超凈臺（型號：GH802-2，天津生物凈化設備廠）、熒光倒置顯微鏡（型號：DMIRB，OLMPUS，Switzerland）。

1.3 細胞培養

PC12細胞培養于完全培養基內（DMEM培養基+10%FBS+1%青鏈霉素雙抗），于37℃，5%CO2的恒溫培養箱內培養。當細胞密度達到70%～80%的對數生長期時，傳代培養或用于實驗研究。

1.4 皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型的構建

1.4.1 皮質酮溶液的配制 皮質酮的分子式：C21H30O4；分子量：346.46；溶解性：10 mmol/L in DMSO；儲存方式：固體粉末可在-20℃下長期保存，溶液密封后可于-20℃下保存一個月。解凍后，稱取10 mg皮質酮粉末并溶解于2.8863 ml DMSO中，配成10 mmol/L皮質酮溶液備用。

1.4.2 皮質酮誘導PC12細胞應激損傷后的細胞活力檢測 檢測不同濃度應激激素（皮質酮，0～1 000μmol/L）在經過不同干預時間（8～48 h）后PC12細胞活力，描述應激激素對細胞活力的影響，篩選模型構建的最佳藥物劑量和干預時間。向已鋪滿PC12細胞的96孔板中加入不同濃度的皮質酮溶液（DMSO，pH：7.4），共設置了7個濃度梯度（25 μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、400 μmol/L、600μmol/L、1 000μmol/L），每組5個復孔，同時設置了細胞未做任何處理的實驗對照組（0 μmol/L），將其置于5%CO2、37℃的恒溫培養箱中培養。分別培養8 h、12 h、24 h、48 h后，用無菌的PBS緩沖溶液洗去各孔中的培養基，重新換上新的培養基和血清（100μl），同時向孔板中加入CCK-8溶液（10μl），37℃下共同孵育1 h，酶標儀測定450 nm處吸光度，計算細胞活力。

細胞活力（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0加藥）-A（空白）］×100%；A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和不同濃度化合物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A（0加藥）：具有細胞、CCK溶液而沒有化合物溶液的孔的吸光度。

1.4.3 皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型的干預條件篩選 依據皮質酮誘導PC12細胞應激損傷后的細胞活力檢測結果，選擇模型的最佳干預條件。在滿足細胞活力保持在半數失活率以下的前提下，選擇皮質酮的干預時間為12 h；皮質酮的干預濃度梯度為25μmol/L，50μmol/L，100μmol/L，150μmol/L，200μmol/L，同時設置DMSO溶劑對照組（solvent control，SC）和細胞未做任何處理的空白對照組（0μmol/L）。將各干預組細胞置于含5%CO2、37℃恒溫培養箱中共同培養12 h后，進行模型構建效果的檢測評價。

1.5 皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型的評價

1.5.1 微量法檢測細胞中MDA及SOD水平 將對數生長期的細胞接種于T25細胞培養瓶內，每瓶5×105cells，每組設置5個重復組。各干預組內細胞MDA和SOD水平檢測按相關試劑盒說明書操作執行。

1.5.2 分光光度法檢測細胞中NADH和LDH水平 將對數生長期的細胞接種于6孔細胞培養板內，每孔2×105cells，每組設置5個復孔。各干預組內細胞NADH和LDH水平檢測按試劑盒說明書操作執行。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 皮質酮對PC12細胞活力的干預效應檢測

實驗結果顯示，隨著PC12細胞暴露在皮質酮溶液中時間的延長和皮質酮濃度的增加，細胞活力逐漸下降（表1）。同時，皮質酮的干預時間為12 h，干預濃度在200μmol/L以下時，細胞活力可保持在50%以上，各組細胞活力呈現明顯的梯度下降趨勢，且各組間細胞活力存在統計學差異（P＜0.01）。因此，可選擇此條件作為皮質酮誘導PC12細胞應激損傷的處理條件。

Tab.1 Changes in cell viability after corticosterone intervention in PC12 cells（%，±s，n=5）

Tab.1 Changes in cell viability after corticosterone intervention in PC12 cells（%，±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs25μmol/L group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs50μmol/L group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs 100μmol/L group；▽P＜0.05，▽▽P＜0.01 vs 200μmol/L group；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01 vs 400μmol/L group；○P＜0.05，○○P＜0.01 vs600μmol/L group

Group（μmol/L） 8 h 12 h 24 h 48 h 0 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 25 0.966±0.022 0.940±0.007** 0.908±0.030 0.802±0.040**50 0.874±0.016**## 0.870±0.014**## 0.859±0.083** 0.727±0.045**##100 0.831±0.024**## 0.844±0.022**## 0.766±0.064**## 0.614±0.047**##△△200 0.684±0.014**##△△▲▲ 0.724±0.048**##△△▲▲ 0.542±0.043**##△△▲▲ 0.336±0.034**##△△▲▲400 0.466±0.036**##△△▲▲▽▽ 0.374±0.040**##△△▲▲▽▽ 0.260±0.031**##△△▲▲▽▽ 0.119±0.011**##△△▲▲▽▽600 0.379±0.059**##△△▲▲▽▽▼▼ 0.277±0.037**##△△▲▲▽▽▼▼ 0.206±0.034**##△△▲▲▽▽ 0.061±0.004**##△△▲▲▽▽1000 0.309±0.018**##△△▲▲▽▽▼▼○0.232±0.015**##△△▲▲▽▽▼▼○○0.098±0.022**##△△▲▲▽▽▼▼○ 0.028±0.004**##△△▲▲▽▽▼▼

2.2 皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型的驗證與評價

2.2.1 皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型MDA及SOD水平變化 檢測結果顯示，不同濃度皮質酮干預PC12細胞后，胞內MDA水平呈上升趨勢。相比于空白對照組，皮質酮濃度在25μmol/L以上的各組間的MDA水平差異有統計學意義（表2）。胞內SOD水平呈下降趨勢。相比于空白對照組，與皮質酮濃度為25μmol/L和50μmol/L的兩組間的SOD水平差異雖無統計學意義，但仍然存在下降趨勢（表2）。通過這兩個指標基本可確認隨著皮質酮濃度的升高，細胞應激損傷逐漸加重。

Tab.2 Changes of MDA and SOD after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

Tab.2 Changes of MDA and SOD after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs0μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs25μmol/L group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs50μmol/L group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs 100μmol/L group；▽P＜0.05，▽▽P＜0.01 vs 150μmol/L group；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01 vs 200μmol/L group

Group（μmol/L）MDA（nmol/mg prot）SOD （U/mg prot） 0 0.509±0.025 0.897±0.045 25 0.962±0.058** 0.827±0.030 50 0.872±0.047** 0.821±0.034 100 1.317±0.060**##△△ 0.792±0.027*150 1.054±0.052**##△△▲▲ 0.655±0.018**##△△▲▲200 1.232±0.050**##△△▲▲▽▽ 0.582±0.027**##△△▲▲Solvent control 0.661±0.068**△△▲▲▽▽▼▼ 0.841±0.034▲▽▽▼▼

2.2.2 皮質酮誘導的PC12細胞梯度應激損傷模型NADH及LDH水平變化 檢測結果顯示，不同濃度皮質酮干預PC12細胞后，胞內NADH水平呈上升趨勢。相比于空白對照組，與皮質酮濃度在50 μmol/L以上的各組間的NADH水平差異有統計學意義，與皮質酮25μmol/L組間的NADH水平差異無統計學意義，但仍呈現上升趨勢（表3）。不同濃度皮質酮干預PC12細胞后，細胞LDH水平呈上升趨勢。相比于空白對照組，與皮質酮濃度在150 μmol/L以上的各組間的LDH水平差異有統計學意義，而與皮質酮100μmol/L及以下的各組間的差異無統計學意義，提示皮質酮濃度在100μmol/L以下時對細胞的損害較低（表3）。

Tab.3 Changes of NADH and LDH after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

Tab.3 Changes of NADH and LDH after corticosterone intervention in PC12 cells（±s，n=5）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0μmol/L group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 25μmol/L group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 50μmol/L group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs 100μmol/L group；▽P＜0.05，▽▽P＜0.01 vs 150μmol/L group；▼P＜0.05，▼▼P＜0.01 vs 200 μmol/L group

Group（μmol/L）NADH（nmol/mg prot）LDH （U/mg prot） 0 0.140±0.007 506.684±23.35 25 0.173±0.011 467.885±30.72 50 0.232±0.027** 526.756±20.35 100 0.231±0.002** 545.840±24.01#150 0.363±0.028**##△△▲▲ 707.074±29.06**##△△▲▲200 0.347±0.012**##△△▲▲ 745.471±24.46**##△△▲▲Solvent control 0.148±0.040△△▲▲▽▽▼▼ 519.616±31.63▽▽▼▼

3 討論

細胞梯度應激損傷模型是研究及評估細胞應激損傷程度的可行實驗模型，可用于模擬不同應激水平的實驗對象，滿足階梯型應激增強的實驗需求。依據皮質酮誘導PC12細胞應激損傷后的細胞活力檢測結果，篩選出模型的最佳藥物濃度（0μmol/L～200μmol/L）和干預時間（12 h），滿足各濃度梯度組的細胞活力均在半數衰減量以下，從而排除細胞活力差異過大而產生的混雜因素影響。

為了評估細胞梯度應激模型的構建是否成功，選擇MDA、SOD、NADH及LDH四個生化指標與空白組進行比較。MDA和SOD是評價細胞應激損傷情況的常用指標。生物體內，自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為丙二醛，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性［12，13］。MDA水平是反映機體抗氧化潛在能力的重要參數，可以反映機體脂質過氧化速率和強度，也能間接反映組織過氧化損傷程度［12，13］。SOD是生物體內存在的一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關重要的作用，與很多疾病的發生、發展密不可分［14，15］。檢測模型MDA和SOD水平變化有助于評估細胞的應激損傷情況。研究結果顯示，不同濃度皮質酮干預PC12細胞后，胞內MDA水平呈上升趨勢，胞內SOD水平呈下降趨勢，基本可確認隨著皮質酮濃度的升高，細胞應激損傷程度逐漸加重。

NADH是評價細胞氧化應激的重要指標。研究顯示NADH水平的增加，可刺激離體腦線粒體H2O2的產生增加約10倍。線粒體ROS積累的增加與NADH/NAD+比值的增加有關［16，17］。這主要由于NADH過量積累導致還原應激增加［18］，并可能直接導致O2

·-和H2O2的產生。特別是過量的NADH可被NADH氧化酶（NADH oxidase，NOxs）利用來產ROS［19，20］。有證據表明，在大多數哺乳動物細胞中，缺氧增加細胞NADH水平和ROS的產生。在低氧條件下，線粒體NADH和FADH2不能被線粒體電子傳遞鏈（electron transfer chain，ETC）氧化，導致這些還原當量的積聚和隨后的還原應激［21］。還原應激能使氧的單電子還原形成O2·-，因此是缺氧條件下活性氧產生增加的基礎［21］。本研究發現，隨著皮質酮濃度的增加，干預后的細胞內NADH水平呈上升趨勢，可以反映出細胞處于梯度應激增強的狀態。

LDH廣泛存在于動物、植物、微生物和離體細胞內，是糖酵解的終末限速酶，可催化丙酮酸和乳酸可逆反應，伴隨著NAD+/NADH之間互變。當細胞損傷破裂時，LDH會溢散胞外，因此常作為臨床上指示病情進展的重要指標。LDH升高產檢與心肌梗死、肝疾病及血液疾?。?2，23］。本研究發現當皮質酮濃度增加到150μmol/L以上時，細胞LDH水平呈顯著上升，而皮質酮濃度在100μmol/L以下時，LDH的變化相比于空白對照組無統計學差異。這一方面證明細胞應激程度在逐漸上升，也證明皮質酮對細胞活力的影響較小，可滿足細胞應激程度的穩定維持。

本研究結合應激損傷的研究現狀，構建一種方便可行的細胞梯度應激損傷模型。該方法通過改變激素干預濃度的變化，實現細胞模型應激損傷程度的梯度變化，可以滿足后期應激損傷評價及基礎研究干預的實驗需求。