PAI-1 招募中性粒細胞調控IL-6/STAT3 信號通路促進脂多糖誘導的肺細胞損傷

竇懋森，金文婷，宋元林，潘 玨*

1. 復旦大學附屬中山醫院感染病科，上海 200032

2. 復旦大學附屬中山醫院呼吸與危重癥醫學科，上海 200032

急性肺損傷（acute lung injury, ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）主要表現為由各種局部和全身性損傷引起的呼吸衰竭，后期可發展為多器官功能衰竭［1］。盡管保護肺部的呼吸機策略已獲得較好進展并改善了ALI/ARDS 預后，但由于缺乏有效的治療手段和對疾病發生發展的了解不足，ALI/ARDS 患者病死率仍很高［2］。因此，闡明誘發肺損傷的分子機制對于尋找新的診治靶點和開發臨床治療方法非常重要。

ALI/ARDS 患者常伴肺泡-毛細血管屏障高通透性導致的肺水腫和動脈氧合受損。此外，肺組織中大量炎癥因子積聚和中性粒細胞浸潤也是其主要分子特征［3-4］。當細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 引 起ALI 時， 中 性粒細胞會被激活并被招募到肺泡間隙及肺組織中釋放活性氧、中性粒細胞趨化因子、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等物質［1,4-5］。這些物質雖然能對抗外來入侵的病原體，但過量釋放時也會損傷肺上皮和內皮細胞。用普樂沙福（AMD3100，CXCR4 拮抗劑）、阿法鏈道酶（pulmozyme，人重組DNA 酶）或西維來司他（sivelestat，中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑）抑制中性粒細胞的活化和募集則能緩解感染相關ALI/ARDS 癥狀［6］。因此，中性粒細胞的招募對ALI/ARDS 的發生發展起重要作用，但其發揮作用的分子機制仍不明確。

纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是一種相對分子量為52 000 的糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族成員。PAI-1 能通過與靶蛋白酶相互作用來調節凝血和纖維蛋白溶解。生理情況下，PAI-1 能與組織型纖溶酶原激活物（tPA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）結合而使之滅活［7-8］。研究［9］表明ARDS 患者炎癥和凝血系統之間存在交叉聯系，并提出了“免疫血栓”的觀點。另有臨床試驗［10］結果顯示，血漿PAI-1 是影響ARDS 預后的獨立危險因素。因此，PAI-1 可能調節以中性粒細胞為中心的炎癥過程，并進一步影響ALI/ARDS 的發展和預后。本研究利用LPS 誘導的損傷原代肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar epithelial type Ⅱ cell, AEC Ⅱ）為模型，闡釋PAI-1 能否通過趨化中性粒細胞進而促進肺損傷過程及基本機制，為臨床更好地認識ALI/ARDS 和開發相關治療靶點提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒構建和轉染 PAI-1 基因擴增正向引物 為 5＇-CGCGGATCCGCGATGGACTACAAGG ACGACGATGACAAGCAGATGTCTCCAGCCC TC-3＇；反向引物為 5＇-CCGCTCGAGCGGTCAGG GTTCCATCACTTGGCCCATGAAAAG-3＇， 酶 切位點為BamHI 和XhoI，擴增 25 個。Flag(N＇-DYKDDDDK-C＇)位 于PAI-1 的N 端。 隨 后，PAI-1片段被克隆到pcDNATM3.1(+)形成pcDNA3.1-Flag PAI-1（Invitrogen 公 司 ）， 并 進 行 DNA 測序。HEK293T 由天津市中醫藥研究院饋贈，加入 含 有 10%FBS（Hyclone 公 司） 及 50 g/L 青 霉素/鏈霉素的DMEM（Corning 公司）培養基中，在 37℃、5%CO2條件下培養。轉染前 1 d，將5.0×105個細胞接種到6 孔板，當密度達75%時，用 lipofectamine 2000（Invitrogen 公司）對細胞進行轉染，構建表達載體。第2 天用LPS 處理轉染的HEK293T 細胞，觀察Flag-PAI-1 是否被激活。

1.2 AEC Ⅱ的分離和培養 Sprague Dawley 大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司，均予以常規飲食。于80～90 日齡（最適交配時間）時將雄性和雌性大鼠合籠，最終獲得懷孕19 d 大鼠，取出胎鼠。在超凈工作臺中，用75%乙醇對仰臥位固定的胚胎進行消毒［11-12］。在胸線中線處，用眼科彎鉗沿橫膈膜切開肋骨，暴露胸腔，用另一把無菌眼科彎鉗肘部末端迅速取出肺組織，將肺放在含有鏈霉素和氨芐青霉素的PBS 培養皿中。用PBS 沖洗肺組織以洗凈血跡，用直眼剪刀將肺組織粗略地剪成 1～3 mm 的組織片。用 5～8 倍體積的胰蛋白酶、在37℃水浴條件下消化肺組織片10～15 min。加入含有10% FBS 的DMEM 培養基終止胰蛋白酶反應，3 000×g 離心 10 min，去除多余的上清液。用含有10% FBS 的DMEM 培養基重懸細胞，接種到10 cm 培養皿里，在37℃、5%CO2條件下培養。

1.3 中性粒細胞分離和純化 提取6～8 周齡Sprague Dawley 大鼠 5 mL 全血，抗凝。嚴格按照試劑盒使用說明將血液緩慢加入中性粒細胞分離液（P9200，Solarbio）的上層，室溫下500×g 離心35 min。離心后小心吸取中性粒細胞層并用10 mL PBS 洗滌細胞，250×g 離心 10 min，棄上清，細胞重懸備用。

1.4 CCK8 檢測細胞存活率 采用不同濃度（0、0.01、0.05、0.1、0.5、1 μg/mL） 的 LPS 處理HEK293T 細胞 6 h，以確定LPS 最適濃度。用DMSO、LPS（最適濃度）或LPS（最適濃度）＋PAI-039（10 μmol/L）處理 AEC Ⅱ 6 h 后，收集細胞并進行計數，將1×105個AEC Ⅱ加入96 孔板中，分別于培養 0 h、24 h、48 h、72 h 和 96 h 時加入含有10% CCK8（ab228554，Abcam 公司）的培養基，在37℃、5%CO2條件下孵育3 h，在450 nm 處測量吸光度。PAI-039（HY-15253）為PAI-1抑制劑，購自MCE 公司。

1.5 ELISA 檢測 PAI-1（大鼠中以PAI-1A 表示）重組蛋白加入中性粒細胞培養基中，采用大鼠ELISA 試劑盒，分別檢測腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α；ab236712, Abcam）、白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β；ab255730,Abcam 公司）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6；ab234570, Abcam 公 司 ）、MPO（E4581，BioVision 公 司 ）、MMP-1（ml002968, Mlbio 公司）和血小板/內皮黏附因子（platelet/endothelial cell adhesion molecule，PECAM；ab213175, Abcam公司）。將中性粒細胞懸浮在上層小室中，用DMSO、LPS 或 LPS+PAI-039 處理下層 AEC Ⅱ 2 h后，收集細胞培養基，1 000×g 離心 5 min 獲得上清液，用ELISA 試劑盒分別檢測IL-6、MMP-1 和MPO 的含量。

1.6 中性粒細胞遷移試驗（Transwell） 采用5 μm 孔徑的聚碳酸酯膜 Transwell 小室（Corning公司），在上層小室中加入5×104個中性粒細胞，使其懸浮在無血清的DMEM 培養基中（美侖公司）；在下層培養皿中加入2×105個AEC Ⅱ，分別用 DMSO、LPS 或 LPS+PAI-039 處理 2 h。收集遷移到下層小室的中性粒細胞并計數。去除上室后，AEC Ⅱ繼續培養24 h，用0.4%臺盼藍在室溫下孵育5 min，對死細胞進行染色，在顯微鏡下對臺盼藍染色陽性的細胞進行計數并計算其所占比例。

1.7 免疫印跡試驗 用細胞刮收集處理好的細胞，加入RIPA 緩沖液于冰上裂解30 min，4℃，12 000 ×g 離心 15 min。將上清液轉移到 1 個新的離心管中，加入4×SDS 上樣緩沖液，100℃，加熱10 min。通過SDS-PAGE 電泳分離蛋白質樣 品， 將 蛋 白 質 轉 移 到 0.22 μm 厚 的 PVDF 膜（Millipore 公司）。該膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，用特異性抗PAI-1（ab222754，Abcam 公司）、Flag（F3165, Sigma 公司）、磷酸化 STAT3（Tyr705；9145, Cell Signaling Technology 公 司 ）、 磷 酸 化STAT3（Ser727；9134, Cell Signaling Technology公司）、STAT3（30835, Cell Signaling Technology公司）、Actin（66009-1-Ig, Proteintech 公司）抗體于4℃孵育過夜。隔日，吸除液體，TBST 清洗3 次，每次間隔 15 min，然后加入HRP 結合的親和山羊抗兔IgG（H＋L；SA00001-2, Proteintech公司）和HRP 結合的親和山羊抗鼠IgG（H＋L；SA00001-1, Proteintech 公司）室溫孵育 1 h，TBST清洗3次，每次間隔15 min，使用ECL發光液顯影。1.8 統計學處理 采用 Graphpad Prism 5.0 分析數據，以x±s 表示，并采用雙尾非配對t 檢驗。檢驗水準（α）為0.05。

2 結 果

2.1 LPS 對 AEC Ⅱ 的 PAI-1 的 激 活 和 促 分 泌作 用 CCK8 結 果（圖 1A） 顯 示，LPS 刺 激HEK293T 細 胞 的 IC50 為 0.1 μg/mL。 免 疫 印 跡法結果顯示，外源性PAI-1 蛋白在HEK293T 細胞中成功表達（圖1B）；與PBS 對照組相比，LPS處理組HEK293T 細胞中PAI-1 表達量增加（圖1C）；LPS 處理后，PAI-1 蛋白能被偶聯Flag 抗體的蛋白A/G 磁珠從培養基中純化出來（圖1D）。

CCK8 結果（圖1E）顯示，與PBS 對照組相比，LPS 刺激后，AEC Ⅱ的活力顯著降低。免疫印跡法結果（圖1F）表明，LPS 處理后，AEC Ⅱ中PAI-1 蛋白表達量顯著增加。ELISA 結果（圖1G）表明，LPS 處理后，分泌到細胞培養基中的PAI-1 增加（P＜0.01）。

圖1 LPS 對AEC Ⅱ細胞的PAI-1 的激活和分泌作用

2.2 PAI-039 對LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞中PAI-1活化的抑制作用 免疫印跡法結果表明，與DMSO對照組相比，PAI-039 能顯著抑制AEC Ⅱ中PAI-1的表達（圖2A）及LPS 誘導AEC Ⅱ中PAI-1 的表達（圖2B）。ELISA 結果（圖2C）顯示，PAI-039顯著抑制LPS 誘導的PAI-1 蛋白分泌（P＜0.01）。

圖2 PAI-039 對LPS 誘導的AEC Ⅱ中PAI-1 激活和分泌的抑制作用

2.3 PAI-1 招募中性粒細胞對LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷的促進作用 CCK8 結果（圖3A）表明，PAI-1 顯著增強中性粒細胞的活力（P＜0.01）。Transwell 結果（圖3B、3C）表明，PAI-1 重組蛋白能促進更多的中性粒細胞遷移到下層小室（P＜0.01）；LPS 處理組有更多的中性粒細胞遷移到下層小室（P＜0.01）；PAI-039 能顯著抑制LPS 誘導的中性粒細胞遷移（P＜0.01）。臺盼藍染色結果（圖3D）表明，PAI-039 能顯著減少LPS 誘導的AEC Ⅱ的死亡（P＜0.001）。

圖3 PAI-1 招募中性粒細胞對LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷的促進作用

2.4 PAI-039 對IL-6 分泌的抑制作用 ELISA 結果（圖4A）表明，中性粒細胞培養基中加入PAI-1重組蛋白后，促炎癥細胞因子IL-6 升高顯著（P＜0.01），MPO 和MMP-1 水平也升高（P＜0.05）。ELISA 結果（圖4B）表明，LPS 處理后，AEC Ⅱ中IL-6 水 平 升 高（P＜0.001），MPO 和MMP-1水平升高（P＜0.05）；加入PAI-039 后，LPS 誘導的IL-6、MPO 和MMP-1 水平升高被逆轉。

圖4 PAI-039 對IL-6 分泌的抑制作用

2.5 抑制 PAI-1 或 STAT3 對 LPS 誘導的 AEC Ⅱ細胞損傷的減輕作用 免疫印跡法結果（圖5A、5B）顯示，與DMSO 對照組相比，LPS 處理后，AEC Ⅱ中STAT3 Tyr705 磷酸化水平顯著升高，Ser727 磷酸化變化不明顯；PAI-039 和AZD1480（JAK2 抑制劑）顯著逆轉LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞中STAT3 Tyr705 磷酸化水平的升高。臺盼藍染色結果（圖5C）表明，AZD1480 能改善LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷（P＜0.01）。

圖5 抑制PAI-1 或STAT3 對LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷的減輕作用

3 討 論

目前，纖維蛋白溶解和凝血系統與炎癥系統之間的交互影響被證明在ALI/ARDS 的發生發展、嚴重程度和預后方面起重要作用［9］，但是這2 個系統如何影響ALI/ARDS 患者的肺損傷，尤其是分子機制目前尚不明確。PAI-1 為纖維蛋白溶解和凝血系統的重要成員，與炎癥系統共同影響ALI/ARDS的進展。本課題組既往研究［10］發現PAI-1 招募中性粒細胞富集，進而促進LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷，提示血漿中的PAI-1 水平升高與ALI/ARDS 的不良預后有關。PAI-1 主要在內皮細胞、肺上皮細胞和成纖維細胞中表達且表達量較低，在缺氧、氧化應激和LPS 誘導的炎癥刺激等不同條件下表達量增加［13-14］。本研究中，采用LPS 刺激表達Flag-PAI-1 的HEK293T 細胞，初步證明LPS刺激能促進PAI-1 的表達及釋放。進一步探討PAI-1 在用LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷中發揮的作用和分子機制，結果表明，在LPS 刺激下，PAI-1 被激活并分泌到AEC Ⅱ的細胞培養液中，而PAI-039作為PAI-1 抑制劑，能阻斷PAI-1 的激活和分泌，減輕LPS 誘導的肺上皮細胞損傷。該結果提示PAI-1是LPS 誘導肺部損傷的重要一環，而抑制PAI-1 可能成為ALI/ARDS 的潛在臨床治療方法。

Kwak 等［14］表明，中性粒細胞暴露于LPS 時被激活，而PAI-1 能通過激活JNK 來增強該效果，提示PAI-1 能招募中性粒細胞并促進其遷移到ALI/ARDS 患者的肺組織中，從而促進LPS 誘導的肺損傷。隨后，該課題組進一步發現PAI-1 明顯抑制了中性粒細胞的凋亡和胞葬作用［15］，與Zmijewski的研究［16］相一致，說明PAI-1 可能作為一個“不要吞噬我”的信號來調控中性粒細胞。本研究中，PAI-1 重組蛋白明顯抑制了中性粒細胞的死亡，同時能阻斷中性粒細胞的激活和遷移，與上述研究一致。當AEC Ⅱ暴露于LPS 時，更多的中性粒細胞被招募到AEC Ⅱ細胞培養基中，此外，PAI-039 逆轉了PAI-1 對LPS 激活中性粒細胞的增強作用，進一步證明PAI-1 是中性粒細胞招募的一個關鍵因素。對損傷的AEC Ⅱ進行染色發現，PAI-039 抑制了LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞死亡。

既往研究［17-18］表明，當肺細胞被LPS 感染時，被招募的中性粒細胞會分泌促炎癥因子，增加血管通透性，從而促進肺損傷。本研究在中性粒細胞中加入PAI-1 重組蛋白，ELISA 法檢測發現IL-6 升高顯著，由此推測IL-6 可能是PAI-1 激活中性粒細胞進而促進LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷的關鍵炎癥因子。既往研究［19-21］表明，血清中IL-6 水平升高明顯加重肺部炎癥和纖維化，并導致ALI/ARDS預后變差。JAK 可以介導STAT3 的激活，從而干擾先天性和適應性免疫反應的啟動［22］；而且，在LPS 誘導的ALI 肺組織中STAT3 的磷酸化水平升高，與TNF-α、IL-1β、IL-6 等促炎癥細胞因子有關［23］。本研究中，由PAI-1 招募的中性粒細胞中JAK 介導的 STAT3 Tyr705 位點（而不是 Ser727 位點）磷酸化增加，從而促進LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷；PAI-039 有效抑制了 STAT3 Tyr705 位點磷酸化，并減輕了LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷；此外，AZD1480 能抑制STAT3 的Tyr705 和Ser727磷酸化，并減弱了LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷，表明STAT3 激活是PAI-1 招募中性粒細胞富集進而促進AEC Ⅱ細胞損傷的關鍵環節，抑制STAT3的活性能改善PAI-1 募集中性粒細胞促進LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷。圖6 為PAI-1 通過調控中性粒細胞-IL6-STAT3 軸促進LPS 誘導的AEC Ⅱ損傷的模式圖。

圖6 PAI-1-中性粒細胞-IL6-STAT3 軸對LPS 誘導的AEC Ⅱ損傷作用模式

綜上所述，本研究表明，在LPS 刺激下，PAI-1 被激活并釋放到AEC Ⅱ外，促進中性粒細胞募集，后者釋放大量的炎癥細胞因子IL-6，增加STAT3 的Tyr705 位點磷酸化，進而促進LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷；而PAI-039 抑制PAI-1 激活后，中性粒細胞募集減少，IL-6/STAT3 信號通路被抑制，LPS 誘導的AEC Ⅱ細胞損傷獲得緩解。因此，PAI-1 是參與LPS 誘導肺損傷的重要分子，目前研究雖然仍處于起步階段，但為ALI/ARDS 提供了新的視角和理論基礎，并可能為臨床提供以PAI-1 為靶點的臨床干預思路。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。