元寶楓籽油對高脂膳食小鼠脂代謝及腸道健康的影響

安玉紅，關天琪，郭艷紅，李 慧,梁世康，黃 濤

(1.貴州食品工程職業學院 食品工程系，貴陽 551499； 2.貴州玄德生物科技股份有限公司，貴陽 550016)

元寶楓(Acertruncatum)屬槭樹科(Aceraceae)槭屬落葉喬木，為我國特有的木本油料作物，廣泛分布于遼寧、內蒙古、陜西、貴州等地，是集食用油、觀賞、木材于一體的具有較高經濟價值的樹種[1]。魏伊楚等[2]對內蒙古、遼寧、山東、陜西等9個產地的元寶楓籽油進行檢測發現，元寶楓籽的平均含油率為43.30%，元寶楓籽油不飽和脂肪酸含量為87.05%～90.16%，其中亞油酸含量為32.28%，油酸含量為25.36%，神經酸含量為5.25%。2011年我國批準元寶楓籽油為新資源食品[3]，使元寶楓籽油正式進入人們的日常生活。

隨著人們生活水平的不斷提高，功能性油脂具有的保健和藥用功能越來越被認可，功能性油脂的需求量持續增長。元寶楓籽油是目前陸地上已知的食用油脂中神經酸含量較高的功能性油脂，神經酸具有保護和修復腦神經損傷、改善老年癡呆、促進大腦發育等功效[4-5]。但在如今普遍處于高脂、高蛋白膳食的情況下，若將元寶楓籽油作為功能性油脂直接飲用或食用，是否會進一步促進肥胖的加劇，還未見報道。研究表明，攝入大量油脂會影響機體的脂代謝、腸道微生物菌群及腸道微環境[6-8]。目前關于元寶楓籽油作為功能性油脂在改善正常機體腸道菌群，調節腸道菌群的動態平衡方面有一些研究，如：孫朋浩等[9]研究表明，在正常小鼠飼料中添加元寶楓籽可降低小鼠腸道中葡萄球菌屬(Staphylococcus)和放線桿菌門(Acinetobacter)的豐度，說明元寶楓籽有抑制腸道有害菌的作用；梁嬋華等[10]研究表明，元寶楓籽油能改善脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的腸道損傷小鼠結腸組織上皮細胞凋亡和黏膜損傷，其機制與下調 Nod樣受體蛋白3〔NLRP3 炎性小體相關分子NLR家族Pyrin域蛋白3(pyrin domain contain-ning 3, Nlrp3)〕、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(cysteine-aspartic proteases-1, Caspase1)和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)等的mRNA表達有關；陳顯揚等[11]研究表明，元寶楓籽油可顯著降低正常大鼠腸道厚壁菌門、疣微菌門、放線菌門、艾克曼菌和Paramuribaculum等的豐度，顯著增加擬桿菌門和普雷沃氏菌屬 NK3B31等的豐度，另外，對連續7 d 服用元寶楓籽油的10名健康志愿者服用前后的糞便進行16S rDNA測序，結果表明，元寶楓籽油可顯著降低健康志愿者糞便厚壁菌門、放線菌門、變形菌門等的豐度，顯著升高擬桿菌門、乳酸菌的豐度。但元寶楓籽油對高脂膳食機體脂代謝和腸道健康的影響還未見報道。

因此，本文采用高脂膳食誘導小鼠模擬營養過剩誘發的機體肥胖，從小鼠生長狀況、生理生化、盲腸微環境和微生物群等指標研究元寶楓籽油對高脂膳食機體脂代謝和腸道健康的影響，以期為消費者食用元寶楓籽油及元寶楓籽油的開發與應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

元寶楓籽油(油酸含量為24.2%，亞油酸含量為31.7%，神經酸含量為4.38%)，貴州玄德生物科技股份有限公司；60只SPF級昆明種雄性小鼠〔生產許可證號SCXK(遼)2015-0001〕，體質量18～20 g，遼寧長生生物技術股份有限公司；基礎飼料，重慶騰鑫生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒，德國 Qiagen 公司；糞便DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；熒光定量試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，南京建成生物工程研究所；丙酸(純度>99.0%)、丁酸(純度>99.0%)、異丁酸(純度>99.0%)、戊酸(純度>98.0%)、巴豆酸(純度>98%)、丙氨酸(純度>98%)標準品，Sigma公司；己酸標準品(純度≥99.5%)，阿拉丁試劑公司；其他試劑均為分析純。

Thermo TRACE 1310-ISQ LT氣相色譜-質譜聯用儀、Nano Drop 1000微量紫外分光光度計，美國Thermo公司；SG8200HPT超聲波清洗儀；H1-16KR高速冷凍離心機；Light Cycler Nano 熒光定量 PCR儀，美國羅氏公司；SpectraMax190連續波長多功能酶標儀，美國 Molecular Devices公司；L5S紫外-可見分光光度計；CTFD-12S真空冷凍干燥機。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養與樣品采集

將60只昆明種雄性小鼠適應性喂養1周后，按體質量隨機分為空白組、模型組、元寶楓籽油低劑量組和元寶楓籽油高劑量組，每組15只，每5只1籠。其中元寶楓籽油高劑量組灌胃劑量為1 200 mg/(kg·d)，元寶楓籽油低劑量組灌胃劑量為600 mg/(kg·d)元寶楓籽油和600 mg/(kg·d)大豆油(灌胃劑量參考余德林等[12]的方法改進)，而空白組和模型組灌胃1 200 mg/(kg·d)大豆油。模型組和元寶楓籽油組小鼠在實驗期間一直給予高脂飼料飼養，而空白組小鼠給予基礎飼料飼養，每天早上8:30—9:00進行灌胃，實驗期間自由飲水，每3 d稱1次體質量，并調整灌胃量，實驗時間60 d。實驗最后1 d禁食不禁水12 h，乙醚麻醉后，采用鋼尺和軟尺分別測定體長和腰圍；然后眼眶取血，于4℃、4 000 r/min離心15 min，-80℃保存，備用；快速解剖出肝臟、脂肪、盲腸等，稱量質量、分裝，-80℃保存，備用。高脂飼料配方參照美國營養學會AIN-93G標準[13]配制，配方為：基礎飼料78.8%，蛋黃粉10%，豬油10%，膽固醇1%，膽酸鹽0.2%。

1.2.2 Lee′s指數的計算

Lee′s指數(x1)按式(1)計算。

(1)

式中：m為體質量，g；l為體長，cm。

1.2.3 生理生化指標的測定

參考試劑盒說明書，分別測定血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平。

1.2.4 腸道指標的測定

1.2.4.1 盲腸及其微環境指標測定

盲腸內容物pH和水分的測定參考夏雪娟[14]的方法進行；盲腸內容物硫化氫(H2S)的測定參照鄭揚等[15]的方法進行；盲腸內容物氨態氮(NH3-N)的測定參照蒲萬霞等[16]的方法進行；盲腸壁表面積和游離氨含量的測定參照游玉民等[17]的方法進行。

1.2.4.2 盲腸內容物短鏈脂肪酸(SCFA)的測定

參照李明澤等[18]的方法測定盲腸內容物的SCFA。

GC條件：Agilent HP-INNOWAX 毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣量 1 μL，分流比 10∶1；進樣口溫度 250℃； 升溫程序為起始溫度 90℃，然后以10℃/min 升溫至 120℃，再以5℃/min 升溫至 150℃，最后以 25℃/min 升溫至 250℃，保持 2 min；載氣(氦氣)流速 1.0 mL/min。

MS條件：電子轟擊電離(EI)源，SIM 掃描方式，電子能量 70 eV，離子源溫度 230℃，傳輸線溫度 250℃，四極桿溫度 150℃。

1.2.4.3 盲腸內容物微生物測定

按照糞便DNA提取試劑盒提取DNA后，進行純度檢測。各腸道菌群特異性PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應測定各腸道菌群表達量，以各腸道菌群標準為內參計算其表達量[19-20]。

表1 各細菌引物序列及產物大小

1.2.5 數據處理

實驗數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 21.0及Origin 8.1進行數據統計處理，兩組間比較采用Student′st檢驗，多組間比較采用One-Way ANOVA 進行Duncan分析，以p< 0.05為存在統計學差異。

2 結果與分析

2.1 元寶楓籽油對小鼠生長狀況的影響

元寶楓籽油對小鼠生長狀況的影響如表2所示。

表2 元寶楓籽油對小鼠生長狀況的影響(n=15)

由表2可知：與空白組相比，在初體質量差異不顯著的情況下，經過60 d高脂飼養，模型組小鼠終體質量、腰圍、Lee′s指數和腹腔脂肪質量均顯著增加(p<0.05)，分別增加了31.23%、28.29%、28.23%和71.77%；與空白組相比，模型組攝食量顯著降低(p<0.05)，降低了19.36%；與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠攝食量減少，但不顯著(p>0.05),小鼠體質量、腰圍、Lee′s指數和腹腔脂肪質量降低，其中高劑量組作用顯著(p<0.05)。以上結果說明元寶楓籽油具有一定的減肥作用，但其作用效果有一定的量效關系。

2.2 元寶楓籽油對小鼠血清脂質水平的影響

元寶楓籽油對小鼠血清脂質水平的影響如表3所示。

表3 元寶楓籽油對小鼠血清脂質水平的影響(n=15) mmol/L

由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平顯著升高(p<0.05)，分別升了73.68%、62.64%和188.52%，而HDL-C水平顯著降低(p<0.05),下降了49.06%。與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均顯著降低(p<0.05)，HDL-C水平顯著升高(p<0.05)，其中，高劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平降幅分別為21.65%、18.55%和38.07%，而低劑量組小鼠血清中TG、TC、LDL-C的水平降幅分別為9.96%、9.72%和18.75%，高、低劑量組HDL-C水平增幅分別為51.85%和22.22%。以上結果表明，元寶楓籽油具有改善因高脂膳食誘導的小鼠血清脂代謝紊亂的作用，但不能將高脂膳食小鼠恢復到正常水平，具體作用機制還有待進一步研究。

2.3 元寶楓籽油對小鼠盲腸及其微環境的影響

腸道是機體主要的消化吸收場所，盲腸和結腸是腸道微生物最密集和多樣的區域。盲腸作為小腸的末端，連接著大腸，此區域是最早接觸到大腸方向來源的微生物群落，因而國內外以盲腸研究腸道健康的報道[17,21-24]較多。元寶楓籽油對小鼠盲腸及其微環境的影響分別如表4和表5所示。

表4 元寶楓籽油對小鼠盲腸的影響(n=15)

表5 元寶楓籽油對小鼠盲腸微環境的影響 (n=15)

由表4可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸總質量和盲腸內容物質量顯著增加(p<0.05)，分別增加了89.47%和114.81%。與模型組相比，元寶楓籽油低、高劑量組小鼠盲腸總質量和盲腸內容物質量增加，且高劑量組增加顯著(p<0.05)?？赡苁窃獙殫髯延椭谢钚晕镔|對小鼠腸道產生了刺激作用，增大了盲腸表面積，加強了小鼠盲腸對營養物質的吸收所致[25]。腸道pH的降低能降低腸癌等腸道類疾病發生的概率[26]，游離氨、硫化氫(H2S)、氨態氮(NH3-N)是腸道健康的重要生物標志物。由表5可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內容物游離氨、氨態氮、硫化氫和pH顯著增加(p<0.05)，分別增加了173.91%、109.52%、18.46%、12.05%，而盲腸內容物水分顯著降低(p<0.05)，降低了 14.06%。與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠游離氨和氨態氮含量顯著降低(p<0.05)，高劑量組硫化氫含量和pH顯著降低(p<0.05)。以上結果說明，高脂膳食會影響小鼠盲腸及其微環境，而元寶楓籽油可降低因高脂膳食造成的小鼠盲腸代謝產物的毒害損傷。

2.4 元寶楓籽油對小鼠盲腸內容物SCFA的影響

腸道SCFA可以反映機體腸道內厭氧菌的數量和代謝情況，其組成和含量與腸道微生物菌群存在一定的相關性，如乙酸、丁酸和丙酸與瘤胃球菌屬(Ruminococcus)和乳酸菌(Lactobacillus)呈正相關，而丁酸與雙歧桿菌(Bifidobacterium)和阿克曼氏菌(Akkermansia)呈正相關[27]。元寶楓籽油對小鼠盲腸內容物SCFA的影響如表6所示。

表6 元寶楓籽油對小鼠盲腸內容物SCFA的影響(n=15) μmol/g

由表6可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內容物中SCFA總量、丁酸、異丁酸、戊酸和丙酸含量顯著降低(p<0.05)，分別降低了28.09%、32.74%、11.22%、18.67%和25.65%。與模型組相比，元寶楓籽油可增加小鼠盲腸內容物中SCFA總量、丁酸、戊酸、丙酸和異丁酸含量，其中：元寶楓籽油高劑量組小鼠盲腸內容物中SCFA總量、丁酸、戊酸和丙酸的含量顯著增加(p<0.05)，分別增加了19.93%、25.54%、9.94%和18.31%；而低劑量組小鼠盲腸內容物中丙酸含量顯著增加(p<0.05)，增加了23.94%。以上結果表明，元寶楓籽油具有促進高脂膳食機體腸道內的發酵反應，改善腸道菌群穩態失調的作用。

2.5 元寶楓籽油對小鼠盲腸內容物中微生物的影響

元寶楓籽油對小鼠盲腸內容物中微生物的影響如表7所示。

表7 元寶楓籽油對小鼠盲腸內容物中微生物的影響(n=15) lg(copies)/g

由表7可知，與空白組相比，模型組小鼠盲腸內容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌的量顯著降低(p<0.05)，分別下降了28.88%、18.41%和29.76%，而腸桿菌、腸球菌和擬桿菌的量顯著升高(p<0.05)，分別上升了24.09%、28.79%和15.73%。與模型組相比，元寶楓籽油高、低劑量組小鼠盲腸內容物中乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭菌的量均顯著增加(p<0.05)，而腸桿菌、腸球菌和擬桿菌的量顯著減少(p<0.05)。以上結果表明，元寶楓籽油可改善因高脂膳食造成的小鼠盲腸代謝產物的毒害損傷，增加有益微生物，促進腸道健康。

3 結 論

以高脂膳食小鼠模擬機體營養過剩，從生長狀況、血脂、腸道微環境3個方面研究元寶楓籽油對高脂膳食小鼠脂代謝和腸道健康的影響。結果表明：元寶楓籽油直接飲用或食用，并未加重高脂膳食小鼠脂代謝紊亂，以及促進肥胖的發生；但元寶楓籽油并不能將高脂膳食小鼠恢復到正常水平。此外，元寶楓籽油可改善因高脂膳食造成的小鼠盲腸代謝產物的毒害損傷，增加有益微生物量，具有一定的維持腸道健康的作用。后續將采用16S rDNA測序、代謝組學、轉錄組學及網絡藥理等進一步探明元寶楓籽油對高脂膳食機體脂代謝和腸道健康的影響機制。