甜葉菊水分脅迫響應基因SrDREB2A克隆及表達分析

張婷，楊永恒，孫玉明，徐曉洋，王銀杰，張永俠，原海燕

（江蘇省中國科學院植物研究所/南京中山植物園，南京 210014）

0 引言

菊科多年生草本植物甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）是一種新興保健型糖料作物，原產于南美巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脈，在當地已有數百年的食用歷史。其葉片中富含的甜菊糖苷是一類四環二萜類物質，因具有高甜度（約為蔗糖的300～400 倍）、低熱量（約為蔗糖的1/300）、預防和輔助治療高血壓、糖尿病和腫瘤等疾病的功效而被廣泛應用于食品、飲料和醫藥等領域[1-2]。自1976 年首次從日本引種種植成功以來，目前我國已成為世界甜葉菊種植與原料生產和出口最大的國家，其中甘肅、新疆和內蒙古等省區則因為其日照較長、病蟲害發生較輕等獨特的區位優勢已逐漸發展成為甜葉菊的優勢產區[3]。然而，這些區域氣候干燥且降水量少，而甜葉菊屬淺根系植物、喜濕不耐旱[2]，因此提高其耐旱性對于降低甜葉菊原料生產成本及節約水資源都具有重要意義。

AP2/ERF 類蛋白是植物特有的一類轉錄因子，它們均包含由大約60 個氨基酸組成的AP2 保守結構域。該家族可進一步被分為AP2、ERF、RAV、DREB 和Soloist 五個亞家族[4]，其中DREB 亞家族又進一步被分為A-1～A-6亞組，A-1亞組蛋白主要參與植物冷脅迫響應，而A-2 亞組蛋白則在抗旱及耐熱方面起重要作用[5]，這兩個亞組蛋白均可結合含有DRE/CRT 元件基序從而啟動下游基因表達[6]。擬南芥中A-2 亞組包含8 個DREBs，其中只有DREB2A和DREB2B能夠被干旱脅迫顯著誘導表達，表明這兩個轉錄因子可能在該亞組中起主要作用[7]。對AtDREB2A 蛋白激活活性研究發現其靠近AP2 結構域的部位存在一段負調控區域，去除這段序列（AtDREB2A CA）可以顯著提高AtDREB2A的轉錄激活活性。過表達AtDREB2A CA可以明顯增強植株的耐旱性，而過表達AtDREB2A基因全長則不能，表明AtDREB2A可能存在轉錄后修飾[8]。除了At-DREB2A，過表達水稻、玉米和蘋果等的DREB2A同源基因均可提高植株的耐旱性[9-11]，表明DREB2A在不同物種中的功能具有保守性。

本研究通過同源克隆的方法在甜葉菊中克隆擬南芥AtDREB2A的同源基因，對其組織表達及水分脅迫響應模式進行分析，并進一步明確其亞細胞定位和轉錄激活活性。以上研究為后續進一步明確SrDREB2A的分子功能及通過轉基因手段提高甜葉菊的耐旱性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與種植條件

本試驗采用的甜葉菊品種為‘中山6 號’，保存于江蘇省中國科學院植物研究所甜葉菊種質資源圃。取生長一致的甜葉菊插穗扦插于營養土∶蛭石=1∶1的基質中，待生長至6片左右完全展開葉后取出植株并將根部洗凈。自然失水脅迫處理方法參照張常青等的菊花耐旱性評價方法[12]并略作改動，其中脅迫時間點取0、1、4、8 h。用于亞細胞定位試驗的煙草種植于光照培養箱中，培養基質為營養土∶蛭石=2∶1，培養條件為光照強度80～100μmol/(m2·s)，光周期為16 h光照/8 h黑暗，進行正常的水分管理。

1.2 試驗方法

取‘中山6 號’根、節、節間、葉以及自然失水脅迫試驗的甜葉菊葉片于液氮中速凍，然后于-80 ℃保存。利用Trizol 試劑（TAKARA）提取總RNA，之后根據PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit（TAKARA,D6110A）試劑盒進行反轉錄得到cDNA。通過擬南芥AtDREB2A（NCBI 登錄號：AED90871）的序列信息，在本課題組甜葉菊轉錄組庫中進行同源性比對，并利用NCBI在線引物設計網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計引物SrDREB2A-F/R（引物序列見表1）進行同源基因克隆。利用Pfu 高保真酶（TAKARA）進行擴增，擴增產物連接到pEASY-Blunt（全式金）載體上后轉化大腸桿菌感受態DH5α細胞并涂布于含有氨芐抗性的LB培養基上，37 ℃過夜培養。挑取生長出的單克隆菌落進行PCR驗證，然后進行瓊脂糖凝膠電泳并選取含有目的條帶的菌液委托測序公司（通用生物）進行測序進而得到目的基因序列。

表1 研究所用的PCR 引物Table 1 PCR primers used in this study

1.2.2 qRT-PCR分析

利用SYBR Premix Ex Taq 試劑（TAKARA）在CFX96 定量PCR 儀（BIO-RAD 公司）對SrDREB2A在不同組織及不同失水脅迫時間點進行定量分析，內參選擇β-Actin（AF548026），并利用2-ΔΔCt方法計算SrDREB2A的相對表達量[13]。定量引物見表1。

1.2.3 進化樹構建及結構域分析

在NCBI網站通過在線BLAST序列比對，下載不同物種中DREB 亞家族蛋白序列，并利用MEGA 5.0軟件對所有序列進行系統進化樹構建，選擇Neighbor-joining 方法，Bootstrap 參數值設為1 000。另外將SrDREB2A 蛋白序列提交NCBI進行結構域分析，利用DNAMAN 軟件將SrDREB2A 及其同源序列進行多序列比對并標注結構域所在位置。

1.2.4 亞細胞定位

利用SrDREB2A-GFP-F/R 引物（序列見表1）對SrDREB2A全長序列進行擴增，然后利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit試劑盒（諾唯贊公司）并通過同源重組方法插入到pCAMBIA1305-GFP空載的GFP基因序列上游。GFP空載及SrDREB2A-GFP載體通過農桿菌介導的瞬時轉化方法注射進生長5周左右的健康煙草葉片中。對煙草進行正常管理，2 d后利用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）觀察綠色熒光的定位情況。

1.2.5 轉錄激活活性分析

粗糙集理論作為一種新型的信息處理數學工具，主要應用于已知信息不精確、不完備、不統一等場合?？茖W合理地將灰色系統理論和粗糙集理論進行結合，能更好地解決信息不確定、不完全處理領域的問題。粗糙集理論的重點內容是知識約簡，即利用已知的決策對象、決策指標、灰色聚類結果形成一個原始決策表，考慮到元動作單元故障模式的已知數據存在不完全性并且聚類結果存在灰性(即信息不精確)的特點，若直接對所建立的原始決策表進行知識約簡，那么很可能會導致極小決策算法與問題的實際意義相悖。為了優化決策算法，使決策規則更具柔性，筆者先對原始決策表進行離散化處理，然后對它進行知識約簡。

選擇合適的帶酶切位點的引物（引物序列見表1）對構建在pEASY-Blunt 載體上的SrDREB2A序列進行擴增，得到SrDREB2A全長片段，然后利用膠回收試劑盒對產物進行回收，并通過同源重組的方法構建在pGBKT7 載體上。利用酵母轉化試劑盒（Clontech）將pGBKT7 空載及目的質粒轉化進酵母感受態細胞AH109，然后涂布于SD/-Trp 營養缺陷型培養基。30 ℃倒置培養3 d 后，隨機選取3 個克隆分別用無菌ddH2O 重懸，點至SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal培養基上，30 ℃培養3～5 d。

分別隨機取3 個轉化進pGBKT7-SrDREB2A、pGBKT7 空載的酵母單克隆用2 mL無菌ddH2O 重懸，點至SD/-Trp/-His及SD/-Trp/-His含不同濃度3AT 的培養基上（3AT濃度設置為0、10、20、30、40、50、75、100 mmol/L），倒置培養3～5 d后觀察酵母生長情況。

根據結構域將SrDREB2A基因序列截斷成不同長度，并通過同源重組方式分別構建在pGBKT7 載體上。構建成功的載體質粒及pGBKT7 空載轉化酵母感受態細胞AH109，并涂布于SD/-Trp 培養基，30 ℃倒置培養3 d。挑取單克隆于SD/-Trp液體培養基中培養，然后利用CPRG作為反應底物測定其β-gal活性。

1.3 數據分析

試驗數據利用EXCEL 2010軟件進行處理，采用SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 SrDREB2A基因克隆與結構域分析

通過同源克隆的方法我們從甜葉菊中獲得了SrDREB2A的全長序列并提交NCBI網站進行序列登錄（登錄號：MK163642）。該基因編碼區長度為903 bp，編碼301個氨基酸殘基，通過BioXM 軟件預測的蛋白分子量和等電點分別為33.12 kDa 和5.15，具有一個典型的AP2 結構域（圖1A）。進化樹分析表明，SrDREB2A 屬于DREB亞家族的A-2亞組，與青蒿AaDREB2蛋白親緣關系最近（圖1B）。

圖1 SrDREB2A序列及進化分析Fig.1 Sequence and phylogenetic analysis of SrDREB2A

2.2 SrDREB2A表達模式分析

對甜葉菊根、節、節間和葉片組織定量分析發現，SrDREB2A在葉片和節中的含量較高（圖2A），其中葉片中最高，約為節間和根中表達量的2 倍。甜葉菊葉片為其收獲器官并且相對于其它組織對水分脅迫更為敏感，另外由于SrDREB2A在葉片中表達量更高，所以我們更關注其在葉片中的功能。自然失水脅迫試驗表明，葉片中的SrDREB2A表達水平隨著脅迫時間的延長而急劇升高（圖2B），其中脅迫8 h 升高尤為顯著，分別為脅迫0、1、4 h的184、158和18倍，表明葉片中SrDREB2A受水分脅迫顯著誘導表達。

圖2 SrDREB2A表達模式分析Fig.2 The expression pattern of SrDREB2A

2.3 SrDREB2A亞細胞定位

轉錄因子進核對于其行使功能至關重要。煙草亞細胞定位試驗結果顯示，空載體GFP分布于細胞核和細胞質，而SrDREB2A-GFP 的綠色熒光信號主要集中在細胞核中（圖3），表明SrDREB2A 為細胞核定位蛋白，與其轉錄因子功能相吻合。

圖3 SrDREB2A煙草表皮細胞中亞細胞定位分析Fig.3 Subcellular localization analysis of SrDREB2A in N.benthamiana epidermal cells

2.4 SrDREB2A轉錄激活活性分析

3 次重復試驗均顯示轉化進pGBKT7 空載的酵母能在SD/-Trp 培養基上生長，但并不能在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade及SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal培養基上生長。而轉化進SrDREB2A 的酵母細胞均能夠在4種培養基上生長，并且能在SD/-Trp/-His/-Ade+x-α-gal培養基上顯色（圖4），表明SrDREB2A 具有轉錄激活活性。

圖4 SrDREB2A轉錄激活活性分析Fig.4 The transactivation activity of SrDREB2A

為了進行后續的酵母雙雜交篩選試驗，對抑制SrDREB2A 激活活性的3AT 濃度進行了篩選。3 次重復試驗結果均發現較高濃度（100 mmol/L）3AT 并不能夠抑制轉化進SrDREB2A酵母細胞的生長（圖5），表明SrDREB2A具有較強的轉錄激活活性。

圖5 3AT抑制SrDREB2A轉錄激活活性分析Fig.5 Analysis of 3AT inhibiting SrDREB2A transactivation activity

根據SrDREB2A 蛋白結構域所在位置對其進行分段并構建BD 載體。將不同載體轉化入酵母細胞并對其β-gal 活性進行測定，結果表明SrDREB2A 的轉錄激活活性區段位于R（211～301 aa）段，并且缺失149～179 aa 區段并不影響SrDREB2A 的激活活性，而此區段據報道對擬南芥同源蛋白的活性具有抑制作用。此外，F（1～210 aa）段不具有轉錄激活活性（圖6），因此可用于后續的酵母雙雜交篩選，以便對其功能進行深入的研究。

圖6 SrDREB2A全長及不同區段β-gal活性測定Fig.6 The β-gal activity of full length and different truncated version of SrDREB2A

3 討論

目前關于甜葉菊耐旱方面的研究多集中于干旱條件下生理指標的變化及根據相關生理指標對甜葉菊不同品種耐旱性進行評價等方面。例如，任廣喜等[14]通過終止灌溉5、10和15 d使甜葉菊植株處于不同干旱脅迫狀態，然后測定5 份甜葉菊種質材料中的可溶性蛋白、相對電導率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶、過氧化物酶活性及單株干葉產量等，從而對耐旱性強弱進行評價。SRIVASTAVA 等[15]通過對盆栽甜葉菊供給不同水平水分來研究在水分脅迫條件下甜葉菊的形態、生理指標變化及甜葉菊對水分脅迫的耐受性。研究發現水分脅迫下甜葉菊葉片電導率水平急劇增加，株高和葉面積都顯著降低，抗氧化酶活性在輕度水分脅迫下有所提升而在重度干旱脅迫下降低。以上結果表明甜葉菊對水分脅迫十分敏感，因此在實際栽培過程中要保持合適的水分管理[16]。外源物質添加在緩解干旱脅迫方面已有較多報道，在甜葉菊中PRADHAN[17]發現一氧化氮和腐胺單獨或聯合施用可以降低干旱脅迫對甜葉菊試管苗的傷害。以上研究都較為淺顯，而甜葉菊耐旱基因的挖掘及基于耐旱基因的分子育種方面的研究則尚未報道。

AP2/ERF 類轉錄因子參與了植物的生長發育和脅迫抗性等多個方面，本項目組前期克隆了該家族中與甜葉菊耐寒性相關的SrDREB1A1和SrDREB1A2及調控根發育的SrERF5基因[3,18]。本研究在此基礎上進一步通過分子生物學手段同源克隆了甜葉菊中的SrDREB2A基因，水分脅迫可以強烈誘導該基因的表達，暗示其很可能正向調控甜葉菊的耐旱性。轉錄激活試驗表明，SrDREB2A 的轉錄激活區段位于該蛋白C端，與擬南芥中AtDREB2A相類似，但去除在擬南芥中被證實具有抑制調節功能的149～179 aa區段[8]，并沒有使其轉錄激活活性提高，表明甜葉菊中SrDREB2A 可能存在一定的功能分化。在不參與逆境脅迫的情況下，過表達AtDREB2A 并不能誘導下游基因的表達，因此推測在非逆境脅迫情況下AtDREB2A 處于一種非激活狀態，而逆境脅迫通過翻譯后修飾從而使AtDREB2A 得以激活下游基因的表達。其中磷酸化被認為是一種很可能存在的修飾模式[19-20]，此外AtDREB2A還存在泛素化修飾狀態，相關的互作蛋白DRIP1、DRIP2、BPM等相繼被克隆[21-22]。酵母雙雜交手段被認為是尋找目的蛋白的互作蛋白，從而進一步闡釋其功能的一種重要手段，而前期明確目的蛋白的轉錄激活活性是進行此項試驗的基礎保證。利用序列全長進行酵母篩庫工作很可能會比用截斷的蛋白得到更多信息，但試驗發現即使較高濃度的3AT也不能夠抑制SrDREB2A 的轉錄激活活性，因此利用全長進行篩庫并不可行。因此，對SrDREB2A 序列進行截斷分析，發現1～210 aa區段不具有激活活性，為后續通過酵母雙雜交篩庫探究SrDREB2A蛋白調控功能奠定了基礎。

4 結論

（1）SrDREB2A屬于DREB亞家族A-2 亞組，具有一個典型的AP2 結構域。該基因在葉片中表達量較高并且受水分脅迫顯著誘導，表明SrDREB2A作為提高甜葉菊耐旱性的基因資源并可用于甜葉菊的耐旱育種工作。

（2）SrDREB2A 定位于細胞核并且具有較強的轉錄激活活性，其F（1～210 aa）區段可用于后續的酵母雙雜交篩庫研究。