黏蛋白1與腫瘤相關蛋白的調控網絡研究

褚云開，廖春華，鄧華云，黃 雷

上海交通大學醫學院組織胚胎學與遺傳發育學系，上海 200025

黏蛋白1（mucin1，MUC1）屬于黏蛋白家族，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，相對分子質量120 000～225 000。在正常組織中，MUC1 廣泛表達于消化道和呼吸道等分泌型上皮細胞管腔表面，呈極性分布，起潤滑和保護作用［1］。在腫瘤組織中，MUC1失去極性，均勻地表達在腫瘤細胞表面；此時，腫瘤細胞蛋白水平異常升高，可達正常細胞的50～100 倍。臨床研究［2-3］表明，MUC1 水平與腫瘤的發生發展密切相關。

MUC1通過和多種腫瘤相關蛋白相互作用，促進腫瘤的發生發展。MUC1 與核因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB）和p65 轉錄因子形成復合物，上調尿激酶型血漿素原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）轉錄水平，增加卵巢癌細胞的侵襲性［4］；另一方面，MUC1 激活NF-κB 信號通路，誘導M2 型巨噬細胞浸潤，促進腫瘤形成［5］。MUC1 也可結合轉錄因子p53 并抑制其活性，減少細胞凋亡；還有報道表明MUC1-C與雄激素受體（androgen receptor， AR） 的DNA 結 合 結 構 域（DNA-binding domain，DBD）結合，占用并抑制前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）啟動子，誘導前列腺癌細胞的侵襲和上皮間質轉化［6］。MUC1 還與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）相互作用，激活EGFR/三磷酸腺苷結合盒B 亞家族成員1 轉運蛋白（ATP-binding cassette subfamily B member 1 transporter，ABCB1）信號軸和EGFR/白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）信號，導致腫瘤干細胞增殖及化學治療（化療）獲得性耐藥［7-8］的產生。

除了核受體相關蛋白，MUC1還和多種細胞質蛋白 結 合 。 MUC1 與 磷 酸 肌 醇 -3- 激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）結合并激活PI3K/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號軸促進腫瘤的發展［9］。MUC1 通過與β-連環蛋白（β-catenin）相互作用并使其穩定，激活Wnt信號通路，導致細胞惡性轉化［10-12］。MUC1 與共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）蛋白相互作用，促進DNA 修復，導致乳腺癌細胞系對放射治療（放療）不敏感［13］。最近研究發現MUC1 與E3 泛 素 連 接 酶WWP1 （WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1）相互作用，并闡明了WWP1 通過內體-自噬-溶酶體途徑降解MUC1的分子機制；更重要的是，我們發現蛋白酶體抑制劑可激活該降解作用，進而抑制MUC1介導的腫瘤增殖和腫瘤干細胞自我更新［14］。

為了更全面地了解MUC1與腫瘤的關系，揭示新的作用機制，本文針對MUC1在不同癌癥中的水平及其對患者生存的影響進行分析研究。同時，通過免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、液相色譜-串 聯 質 譜 （liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）聯用的方式得到MUC1在細胞內的結合蛋白，用生物信息學分析其調控網絡，以期為MUC1 陽性的腫瘤的發病機制研究和MUC1新功能發掘提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胚胎腎細胞HEK293T 來源于中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM 高糖培養基和PBS（上海源培生物科技股份有限公司，中國），100 mm細胞培養皿（上海越夷生物科技有限公司，中國），SDSPAGE 預制膠、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素和Nano293T 轉染試劑（蘇州新賽美生物公司，中國），胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco 公司，美國），HA-beads（Santa Cruz，美國），考馬斯亮藍染液（500 mL 甲醇+100 mL 冰乙酸+400 mL ddH2O+考馬斯亮藍），考馬斯亮藍洗脫液（500 mL甲醇+100 mL 冰乙酸+400 mL ddH2O），NETN150細胞裂解液（2.5 mL 50 mmol/L Tris pH7.6+2.5 mL 100 mmol/L NaCl+2.5 mL 0.5% NP 40+ddH2O 定容至50 mL）。超凈工作臺（Thermo，美國），Western blotting 蛋白電泳儀（Bio-Rad，美國），超聲波破碎儀（Bio-Rad，美國），高速冷凍離心機（Thermo，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將HEK293T 細胞放入含有10%FBS的DMEM培養液中培養。

1.2.2 HEK293T 細胞轉染 細胞匯合度約60%時，用Nano293T 轉染試劑，轉染vector-HA 或MUC1-HA質粒，48 h后收集細胞。

1.2.3 質譜樣品制備和檢測 用NETN150 細胞裂解液裂解細胞，定量后與HA-beads 4 ℃孵育過夜。將樣品以16×g離心10 min。樣品經SDS-PAGE 膠分離，進行考馬斯亮藍染色［14］。染好的凝膠送上海交通大學基礎醫學院質譜平臺進行LC-MS/MS檢測。質譜譜圖分析、結果分析均由上海交通大學基礎醫學院質譜平臺完成。

1.2.4MUC1差異性表達和生存分析 使用GEPIA 2（gene expression profiling and interactive analyses 2）在線分析平臺（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）分析癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中MUC1在33 種癌癥中的轉錄水平。篩選MUC1高表達癌癥作預后生存分析，采取Kaplan-Meier方法，并評估風險比（hazard ratio，HR）、95%置信區間（confidence interval，CI）和Log rankP值。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

1.2.5 MUC1結合蛋白的分析和相互作用網絡構建使用String 11.5（https：//string-db.org/）這一能在線搜索已知蛋白質之間相互作用的數據庫。選［Multiple proteins］ 并輸入質譜分析得到的526 個MUC1 結合蛋白，［Organism］ 選［homo sapiens］；在［minimum required interaction score］將置信度得分設置為0.9［15］。對蛋白進行基因本體數據庫（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 信號通路分析，同時構建蛋白相互作用網絡。

1.3 統計學方法

使用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計。組間比較采用Student'st檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MUC1在多種腫瘤組織中高表達

本研究用GEPIA 2 在線平臺分析了33 種癌癥中MUC1的轉錄水平（圖1）。MUC1在乳腺癌（breast carcinoma，BRCA）、宮頸癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）、彌漫性大B 細胞瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、多發性膠質細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）、低級別腦膠質瘤（brain lower grade glioma，LGG）、卵巢癌（ovarian carcinoma， OV） 、 胰 腺 癌 （pancreatic adenocarcinoma， PAAD）、 胸 腺 癌 （thymoma，THYM） 和子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）共9 種惡性腫瘤中高表達（紅色）；在腎上腺皮質癌（adrenocortical carcinoma，ACC）等6 種惡性腫瘤中低表達（綠色）；在膀胱尿路上皮細胞癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）等18種惡性腫瘤中無明顯差異（黑色）。

圖1 MUC1在不同腫瘤組織中的轉錄水平Fig 1 Transcription levels of MUC1 in different tumor tissues

2.2 MUC1 高表達與多種惡性腫瘤患者生存期較短相關

為進一步探究MUC1高表達對不同惡性腫瘤患者生存期的影響，我們對上述9 種MUC1高表達的惡性腫瘤患者進行總體生存期（overall survival，OS）分析。在乳腺癌（BRCA，P=0.001）、宮頸癌（CESC，P=0.044）、多發性膠質細胞瘤（GBM，P=0.049）、低 級 別 腦 膠 質 瘤（LGG，P=0.000）、 胰 腺 癌（PAAD，P=0.008） 和 胸 腺 癌（THYM，P=0.035）6種腫瘤中，MUC1高表達組患者的OS較短，并具有統計學意義；而在彌漫性大B 淋巴細胞瘤（DLBC，P=0.250）、卵巢癌（OV，P=0.610）和子宮內膜癌（UCEC，P=0.950） 中， 差 異 均 無 統 計 學 意 義（圖2）。

圖2 9種癌癥中MUC1表達與患者OS的關系Fig 2 Relationship between MUC1 expression and OS in 9 kinds of cancers

2.3 MUC1 結合蛋白主要定位于細胞器并與離子通道和酶的活性相關

我們通過質譜發現526 個MUC1 結合蛋白，用String 11.5 在線數據庫對質譜數據進行分析。出乎意料的是，MUC1 結合蛋白在細胞器（organelle）中定位最多，其次才是細胞質（cytoplasm） 和膜結構（membrane）等（圖3A）。進一步對這些蛋白的分子功能進行分析發現（圖3B），排在前面的主要功能是蛋白結合（protein binding）、離子結合（ion binding）和酶活性（catalytic activity）。其他依次為核苷酸結合（nucleotide binding）、 信 號 受 體 結 合（signaling receptor binding）和信號受體活性（signaling receptor activity）。該結果提示MUC1可與不同亞細胞定位的蛋白相互作用，可能參與細胞器、離子通道和酶的功能調控。

圖3 MUC1結合蛋白的亞細胞定位和分子功能分析Fig 3 Subcellular localization and molecular function of MUC1-binding proteins

2.4 MUC1 參與細胞應激等重要生理過程并與代謝性疾病和腫瘤密切相關

我們還進一步分析MUC1 結合蛋白涉及的疾病。結果顯示，MUC1 結合蛋白主要在解剖實體性疾?。╠isease of anatomical entity）、細胞增殖性疾?。╠isease of cellular proliferation）、 代 謝 性 疾 ?。╠isease of metabolism）和癌癥（cancer）中發揮作用（圖4A）。對MUC1 結合蛋白進行GO 功能分析，這些蛋白主要參與調控細胞應激、代謝過程、發育過程和生物合成過程等（圖4B）。用KEGG 富集分析深入研究MUC1結合蛋白的信號通路，發現這些蛋白大多參與代謝相關通路和癌癥相關通路（圖4C）。這些結果提示MUC1在調控細胞應激、代謝過程、發育過程和生物合成過程中發揮重要作用，并與代謝性疾病和腫瘤密切相關。

圖4 與MUC1結合蛋白有關的疾病、生物學進程和信號通路Fig 4 Diseases,biological processes and signaling pathways associated with MUC1-binding proteins

2.5 MUC1結合蛋白參與調控網絡分析

2.5.1 癌癥相關通路 對MUC1 結合蛋白的癌癥相關通路進行深入分析（圖5A），發現主要有：βcatenin、 NOTCH1、 腺 苷 酸 環 化 酶7 （adenylate cyclase 7，ADCY7） 和磷酯酶Cγ-1（phospholipase Cγ 1，PLCG1）等。β-catenin 的上調能激活Wnt/βcatenin （藍色） 信號通路，促進腫瘤惡性轉化。NOTCH1 屬于Notch 家族受體，是在腫瘤組織中最常被檢測到的。Notch 信號通路（紅色）異常與食管癌、胃癌、宮頸癌及結直腸癌密切相關［16］。ADCY7上調會激活cAMP通路介導的抗炎癥反應（綠色）和細胞增殖［17］。而PLCG1 上調能激活成纖維細胞生長因 子 受 體1 （fibroblast growth factor receptor 1，FGFR1）信號軸，抑制炎癥反應并促進多種腫瘤細胞增殖［18］。這些結果提示MUC1 可與上述蛋白發生相互作用，直接調控癌癥相關信號通路來促進腫瘤的發生和發展。

2.5.2 代謝相關通路 從蛋白相互作用關系網絡中能發現，MUC1 結合的代謝通路相關蛋白（圖5B）主要涉及：三羧酸循環（紅色）、脂肪酸代謝（藍色）和丙氨酸/天門冬氨酸/谷氨酸（綠色）代謝。其中，檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）和順烏頭酸酶2（aconitase 2，ACO2）存在于線粒體，均為三羧酸循環中重要的催化酶［19］；乙酰輔酶A 乙酰轉移酶2（acetyl-CoA acetyltransferase 2，ACAT2）主要在腸道和肝臟中表達，在膽固醇生物合成中發揮重要作用［20］。酰 基 輔 酶A 氧 化 酶1 （acyl coenzyme A oxidase 1，ACOX1）是過氧化物酶體脂肪酸氧化的限速酶，在過氧化物酶體途徑的脂肪酸β-氧化中發揮重要作用［21］；丙氨酸乙醛酸氨基轉移酶（alanineglyoxylate transaminase，AGXT）能將乙醛酸轉化為甘氨酸，同時也參與糖異生為細胞供能，而谷氨酸脫氫酶2（glutamate dehydrogenase 2，GLUD2）將谷氨酸可逆氧化脫氨為α-酮戊二酸［22-23］。其中，CS 又和ACAT2 和GLUD2 存在相互作用關系，將三羧酸循環、脂肪酸代謝和氨基酸代謝聯系起來。這些結果表明MUC1 結合蛋白之間的相互作用關系和三羧酸循環、脂肪酸代謝和丙氨酸/天門冬氨酸/谷氨酸代謝密切相關。MUC1可能通過調節上述代謝通路發揮促瘤作用。

2.5.3 cGMP-PKG 信號通路 研究［24］表明，cGMP-依賴cGMP 的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）信號的激活能抑制Wnt/β-catenin 通路，進而抑制黑色素細胞瘤的生長。腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，ADCY）1/3/7/8 等（紅色）屬于ADCY 家族，能催化ATP 向cAMP 轉化，是cAMP 合成的關鍵分子［25］。研究表明cAMP上調能激活cAMP交換蛋白（exchange proteins directly activated by cAMP，EPACs）并促進多種腫瘤細胞的增殖和轉移［26］，同時cAMP 與cGMP 有拮抗作用，cAMP 上調能抑制cGMP-PKG 通路（圖5C）。該結果提示MUC1可能參與ADCY1/3/7/8 的結合和調控，通過抑制cGMP-PKG信號發揮促腫瘤作用。

2.5.4 腫瘤壞死因子信號通路 在MUC1 結合蛋白參與的信號通路中，我們還發現腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 信 號 通 路（圖5D）。TNF-α 通路能抑制腫瘤細胞增殖并誘導凋亡［27］。TNF 誘導腫瘤細胞凋亡途徑主要有：胱天蛋白酶（caspase）介導的凋亡、NF-κB 凋亡通路和Jun激酶（Jun kinase，JNK）凋亡通路。其中，caspase-8 的活化是caspase 信號通路激活的重要環節，caspase-8 活化后將通過級聯反應直接激活下游的caspase-3、caspase-6 和caspase-7，進而裂解細胞骨架蛋白、細胞外基質蛋白和凋亡抑制效應蛋白，使細胞凋亡［28］。絲裂原活化蛋白激酶13（mitogen-activated protein kinase 13，MAPK13）屬于MAPK 家族，活化的MAPK13 能被caspase-3 識別、切割并露出催化結構 域［29］，促 進 凋 亡。JAG1 屬 于Notch 信 號 轉 導 配體，JAG1 降低可抑制乳腺癌MDA-MB-231 細胞增殖并誘導JNK 凋亡途徑［30］。這些結果表明，MUC1 可能參與調控TNF-α 誘導的多種凋亡途徑，影響腫瘤的發生發展。

2.5.5 細胞周期 最后，我們還分析參與細胞周期調控的MUC1 結合蛋白（圖5E）。周期蛋白依賴性激酶7（cyclin-dependent kinases 7，CDK7）、周期蛋白H （cyclin-H，CCNH）、檢查點激酶1 （checkpoint kinase 1，CHEK1）、轉錄因子E2/3/4（transcription factor E2/3/4，E2F2/3/4）與細胞周期調控密切相關（紅色）；其中，CCNH 和CDK7 兩者能形成復合物并推進細胞周期進行［31］；E2F2和E2F3（藍色）均為細胞周期激活因子［32］。這些結果提示MUC1 可能與上述蛋白發生相互作用來調控細胞周期。

圖5 MUC1結合蛋白參與的信號通路Fig 5 Signaling pathways of MUC1-binding proteins

總之，我們通過生物信息學分析發現MUC1結合蛋白參與癌癥、代謝、cGMP-PKG、TNF和細胞周期等腫瘤相關信號通路，提示MUC1在調控腫瘤發生發展中的潛在機制。

3 討論

我們用GEPIA 2對33種腫瘤進行MUC1轉錄水平分析，發現MUC1在乳腺癌、宮頸癌和彌漫性大B細胞瘤等9種癌癥的腫瘤組織中呈現高表達；對這9種癌癥進行生存分析發現，在乳腺癌、宮頸癌、多發性膠質細胞瘤、低級別腦膠質瘤、胰腺導管癌和胸腺癌中，MUC1高表達組患者總體生存期較短且有統計學意義。除乳腺癌和宮頸癌之外，我們首次發現在多發性膠質細胞瘤、低級別腦膠質瘤、胰腺癌和胸腺癌共4 種癌癥中，MUC1高表達患者的總體生存期較短。

為全面了解MUC1在細胞中的蛋白調控網絡，我們通過質譜實驗檢測到526 個MUC1 結合蛋白并進行GO 分析。令人驚訝的是，作為跨膜蛋白的MUC1，其結合蛋白最多定位于細胞器，其次才是細胞質和細胞膜。MUC1 在細胞器的定位目前僅有線粒體的報道，具體功能不明［33-34］。我們發現MUC1 與CS和ACO2 等三羧酸循環關鍵酶存在結合，提示MUC1 可能參與調控三羧酸循環。內質網參與磷脂的合成，一部分會被轉化為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）組成細胞質膜，當細胞受外界刺激后分解為二酰甘油（diacylglycerol， DAG） 和 三 磷 酸 肌 醇（inositol triphosphate，IP3），后者作為PI3K 前體參與PI3KAkt信號通路（圖4C），進而促進腫瘤的發展［35］；我們也發現一些MUC1 結合蛋白具有調控鈣信號通路（calcium signaling pathway）功能（圖4C）。內質網上存在大量鈣釋放激活的鈣通道（Ca2+release activated Ca2+channel，CRAC-C），這些鈣離子通道參與調控內質網應激，通過多種機制促進腫瘤生長、耐藥和轉移［36］。我們的發現與這些細胞器本身的功能相吻合，提示MUC1 可能參與調控多種細胞器功能并影響細胞代謝等生命活動。進一步對MUC1 結合蛋白進行分子功能分析發現，MUC1 結合蛋白主要參與蛋白結合、離子結合和酶活性等功能。有研究［37］表明，MUC1 結合雌激素受體α（estrogen receptor，ERα）并上調Rab31 的轉錄，而Rab31 又能正反饋促進MUC1 的表達，最終促進乳腺癌惡性轉化。EZH2組蛋白甲基轉移酶在各類癌癥中高表達，而MUC1與EZH2 結合并提高其活性，促進腫瘤發生發展［38］；我們的結果與文獻報道一致?？傊?，這些發現表明MUC1 可與不同亞細胞定位的蛋白發生相互作用，可能參與細胞器、離子通道和酶的功能調控，提示更重要的功能有待被挖掘。

對MUC1結合蛋白涉及的疾病進行分析發現，這些蛋白主要涉及解剖實體疾病、細胞增殖性疾病、代謝疾病和癌癥。細胞增殖異常和代謝紊亂也可能導致腫瘤的發生發展，與MUC1在腫瘤中發揮的功能相吻合。對MUC1 結合蛋白的GO 生物學進程分析顯示，這些蛋白主要在應對外來刺激和代謝過程中發揮功能，除此之外我們也觀察到不少蛋白在發育過程（developmental process） 和 上 皮 細 胞 發 育（epithelium development） 中 發 揮 作 用， 這 也 和MUC1 在正常上皮細胞中的保護作用［39］和在小鼠胚胎干細胞中MUC1 降低活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平［40］等發現一致。

我們還對MUC1 結合蛋白進行KEGG 通路分析，這些蛋白主要參與到代謝通路和癌癥相關通路中。首先，異常的能量代謝是腫瘤的特點。在腫瘤生長過程中，除了經糖酵解和三羧酸循環途徑大量生成ATP之外，細胞也需要大量的氨基酸和脂肪等物質［36］，GLUD2 和ACAT2 恰為氨基酸和脂肪酸代謝的關鍵分子。目前尚沒有研究表明MUC1和這些代謝通路上的酶存在相互作用，因此我們推測MUC1 可能通過與兩者相互作用來提高氨基酸和脂肪酸的代謝水平進而促進腫瘤的發生發展。其次，還發現cAMP、Wnt/β-catenin 和Notch 等促腫瘤信號通路，與報道一致［7，11，41］。另外，我們也發現MUC1與TNF-α凋亡通路存在相互作用。有研究表明MUC1 與caspase-8 競爭結合Fas 相關死亡結構域（Fas-associating protein with a novel death domain，FADD）進而減少細胞凋亡［42］，MUC1還可結合JNK1并激活JNK信號通路減少結腸癌細胞凋亡［43］，這些報道與我們的發現相一致。此外，我們還發現MUC1 也參與細胞周期的調控。有研究［44-46］表明E2F2 和E2F3 在小細胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等癌癥中高表達，對腫瘤細胞增殖具有促進作用。在腫瘤細胞中，周期蛋白依賴性激酶9（cyclin-dependent kinases 9，CDK9）普遍上調從而導致有絲分裂被持續激活［47］。我們首次發現MUC1與CDK7和CCNH 相互作用，因此MUC1調控細胞周期也可能是促進腫瘤增殖的機制之一，此結論有待于進一步研究。

綜上，本研究廣泛篩查分析MUC1在不同腫瘤細胞中的表達水平和對患者生存期的影響；采用質譜檢測到526 種MUC1 結合蛋白，對其進行生物信息學分析并探討MUC1結合蛋白主要的分子功能、參與的生物學過程和信號通路，創新性地發現多個新的MUC1結合蛋白，為研究MUC1生物學新功能奠定基礎。未來的工作將深入研究MUC1與氨基酸和脂肪代謝的關系以及MUC1和細胞周期調控的關系，以揭示MUC1在腫瘤中新的生物學功能和作用機制。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

作者貢獻/Authors'Contributions

廖春華、鄧華云參與實驗設計；褚云開參與實驗實施、數據總結、論文寫作和修改；黃雷全程指導論文寫作和修改。所有作者均閱讀并同意最終稿件的提交。

The study was designed by LIAO Chunhua and DENG Huayun. The experiment was conducted，the data was summarized and the manuscript was drafted by CHU Yunkai.The project was designed and the manuscript was revised by HUANG Lei.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-04-01

·Accepted：2022-07-01

·Published online：2022-08-19

參·考·文·獻

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