APOBEC3B調控葡萄膜黑色素瘤復制應激的研究

宗春燕，何 杰，張 哲，賈仁兵，沈鍵鋒

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院眼科，上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室，上海200011

載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化亞基3（apolipoprotein B mRNA editing catalytic subunit 3，APOBEC3） 蛋白家族擁有7 個成員，主要包括APOBEC3A （A3A） 、 APOBEC3B （A3B） 、APOBEC3C （A3C） 、 APOBEC3D （A3D） 、APOBEC3F （A3F） 、 APOBEC3G （A3G） 和APOBEC3H（A3H）［1］，主要功能為催化單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA）上的胞嘧啶脫氨形成尿嘧啶，引起突變。APOBEC 相關的突變可見于多種腫瘤，包括乳腺癌、肺癌、宮頸癌、膀胱癌和頭頸癌等［2-3］。

研究［4-5］表明，APOBEC3B 在多種類型腫瘤的組織和細胞系中高表達，可能是多種腫瘤的主要誘變劑。APOBEC3B 會導致廣泛的C→T 誘變和基因組尿嘧啶水平的升高，從而導致基因組尿嘧啶損傷［6-7］，其所引起的突變特征在乳腺癌、宮頸癌、肺癌（包括腺癌和鱗狀細胞癌）、頭頸癌和膀胱癌中都有所表現［1-2］。APOBEC3B 這種誘變模式可能對癌變過程中體細胞突變起重要作用，并最終導致基因組不穩定［2］。一方面，APOBEC3B 的DNA 誘變能力可促進多種腫瘤發生發展，與其相關的突變可促進腫瘤亞克隆多樣性，增強腫瘤耐藥性［8］。另一方面，APOBEC3B 誘變導致的基因組不穩定為細胞毒性和免疫療法提供了重要機會［9-10］。APOBEC3B 高表達與乳腺癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤的不良預后（包括耐藥性）相關［11-14］。APOBEC3B 高表達使透明細胞卵巢癌對一些基因毒性藥物（如順鉑）治療敏感［15］。APOBEC3B 所誘發的基因組不穩定甚至可能與常規化學治療（化療）藥物（如鉑類）造成的DNA 損傷一起形成新的合成致死組合，使腫瘤細胞對APOBEC3B損傷更敏感。

眼部黑色素瘤主要包括葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma，UM） 和結膜黑色素瘤（conjunctival melanoma，CM），是罕見的黑色素瘤類型，約占所有黑色素瘤病例的5%，但在眼部惡性腫瘤中比例較高［16-17］。其中，UM 是成人最常見的眼內惡性腫瘤，具有高度侵襲性，易復發、轉移，一旦發生轉移，死亡率極高［18］。目前針對UM 靶向治療的研究有限，遠遠不能改善UM 患者預后不良的現狀。本研究擬探索APOBEC3B 在UM 中的關鍵作用通路，確定其作用的關鍵下游基因，以期尋找UM治療新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要儀器 CO2培養箱（Thermo，美國），電泳裝置（Bio-Rad，美國），離心機（Eppendorf，德國），Odyssey紅外成像系統（LI-COR，美國），數字切片掃描儀（3DHIESTECH，匈牙利），HP Scanjet 5590 掃 描 儀（HP，美 國），LightCycler?480 Ⅱ（Roche，瑞士），激光掃共聚焦顯微鏡（Leica，德國）。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640 培養基、DMEM 培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、嘌呤霉素（Gibco，美國），蛋白裂解液RIPA、氨芐青霉素鈉、結晶紫染色液、蛋白酶抑制劑（Sangon Biotech，中國），DH5α 化學感受態細胞（Vazyme，中國）、PolyJet 轉染試劑（SignaGen，美國），Trizol（Invitrogen，美國），限制性內切酶XhoⅠ、EcoRⅠ、BsmBⅠ（NEB，美國）、T4 連接酶（Vazyme，中國）、APOBEC3B 抗體（ab184990，Abcam，英國），β-actin 抗體（66009，Proteintech，美國），磷酸化復制蛋白A 32 kDa 亞基（replication protein A 32 kDa subunit，RPA32）抗體（Ser4/Ser8）（A300-245A-M，Bethyl，美國），熒光二抗（A21206，Invitrogen，美國），ProLong?Diamond 抗淬滅封片劑（Invitrogen，美國），細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒（Beyotime，中國），細胞周期檢測點激酶1（cell cycle checkpoint kinase 1， CHK1） 抑 制 劑 Rabusertib （S2626，Selleck，美國），Applied Biosystems?SYBR?Green預混液（Thermo Fisher Scientific，美國），硫酸羥脲（hydroxyurea，HU）（Selleck，美國）。

1.1.3 細胞和質粒 本研究所使用細胞系包括UM細 胞 系 （92-1、 OMM1、 OMM2.3、 MEL202、MEL270、MEL285、MEL290、MUM2B 和OCM1）、CM 細胞系（CRMM1、CRMM2 和CM2005.1）、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）細胞系（A375、A2058）、視網膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）細胞，以及人腎上皮細胞293。UM 細 胞 系OMM1、OMM2.3、MEL285 和MEL290 由Martine J. Jager 教授（荷蘭萊頓大學醫學中心）饋贈，293 細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，其余細胞系均為上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室庫存。經鑒定，細胞系均無支原體污染。所有UM 細胞、CM 細胞和RPE 細胞均使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，A375、A2058和293 細胞使用含10%胎牛血清的DMEM 培養基，于37 °C 含5% CO2條件的培養箱中培養。載體質粒pGIPZ、lentiCRISPRv2 以及病毒包裝質粒PMD2.G、PSPAX2均為上海市眼眶病眼腫瘤重點實驗室庫存。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學染色 眼黑色素瘤患者組織和色素痣組織均來源于上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院，經上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院倫理委員會批準。組織載玻片通過乙醇進行一系列的脫蠟和再水化，然后用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復。腫瘤切片用含有0.1% Triton X-100 和3% H2O2的5%正常山羊血清在室溫下封閉1 h，然后在4 ℃下與APOBEC3B 抗體（1∶100）孵育過夜。免疫組織化學（immunochemistry，IHC）染色完成后使用數字切片掃描儀進行掃描，使用CaseViewer 軟件可視化觀察掃描圖片。

1.2.2 Western blotting 收獲細胞并用PBS 沖洗3次，用蛋白裂解液RIPA于冰上裂解蛋白，并在4 ℃下離心收集蛋白質上清液。蛋白質樣品定量后取20 μg 總蛋白上樣至SDS-PAGE 電泳凝膠跑膠，待蛋白條帶分離，完成電泳后將蛋白質轉膜至PVDF 膜上。在室溫下用5%牛奶封閉1 h 后，將膜與相應濃度的一抗在4 ℃下孵育過夜。第二日用TBST 溶液洗去多余的一抗后，將膜與熒光二抗于室溫下共同孵育1 h。在使用TBST 溶液洗去多余的二抗后使用Odyssey 紅外成像系統進行顯像。使用Image J 軟件對Western blotting條帶灰度值進行統計。

1.2.3 穩轉細胞系構建 ①APOBEC3B-shRNA 質粒構 建 。 靶 向APOBEC3B的 外 顯 子 序 列（TTAAAGTTGAAAGTGAATGTGG） 設 計 合 成shRNA 編碼序列，經退火后與載體質粒pGIPZ 一起使用限制性內切酶XhoⅠ和EcoRⅠ按照說明書進行酶切，酶切后使用T4 連接酶進行重組，經測序正確后使用。APOBEC3B-shRNA 質粒用于后續APOBEC3B敲低細胞系shAPOBEC3B構建，空載質粒用于對照細胞系shCtrl構建。②CRISPR-Cas9質粒APOBEC3BsgRNA 構 建。 靶 向APOBEC3B的 外 顯 子 序 列（AAATCTCCTTTGGGACACAG） 設計合成sgRNA編碼序列。使用BsmBⅠ核酸內切酶按照說明書對載體質粒lentiCRISPRv2 進行酶切，使用T4 連接酶將退火后的sgRNA 序列重組于lentiCRISPRv2 載體質粒中測序鑒定，測序結果證實插入片斷與設計序列完全一致后使用。APOBEC3B-sgRNA 用于后續APOBEC3B敲除細胞系sgAPOBEC3B構建，空載質粒用于對照細胞系Vector 構建。③慢病毒包裝。使用293 細胞進行慢病毒的包裝，待細胞密度到達70%以上（10 cm皿）時進行。將60 μL PolyJet 轉染試劑加入無血清DMEM 中配制500 μL PolyJet混懸液。配制含有目的質粒（5 μg）、PMD2.G（5 μg）和PSPAX2（10 μg）的質?；鞈乙?。室溫靜置5 min 后，將PolyJet混懸液加入質?；鞈乙褐?，室溫靜置15 min后滴加至293細胞上清液中。培養6 h 后更換新鮮培養基，48 h 后收集病毒液，病毒經0.22 μm 濾頭過濾后用于細胞感染。④靶細胞感染與篩選。將準備感染病毒的細胞以30%的密度接種至培養皿中，待其貼壁后開始病毒感染。更換新鮮培養基后以1∶1 的體積比例將病毒液緩慢滴加至培養基中，并以1∶1 000的比例加入聚凝胺（polybrene）。感染病毒48 h 后更換新鮮的細胞培養基，并使用相應的抗生素如嘌呤霉素（puromycin）進行篩選，使用嘌呤霉素篩選OMM2.3穩轉細胞系時使用的濃度為2 μg/mL。篩選1周后使用Western blotting驗證APOBEC3B敲低或敲除效率。另外，對APOBEC3B敲除的細胞系進行單克隆挑選，挑選出的單克隆細胞株分別通過Western blotting分析和基因組DNA 測序驗證APOBEC3B敲除情況以及基因編輯情況以挑選出成功敲除APOBEC3B的單克隆細胞株。

1.2.4 克隆形成實驗 將OMM2.3 sgAPOBEC3B和Vector 細胞按相應的密度接種至6 孔板，每組樣本設置3個生物學重復。培養2～3周，每隔3 d換液。藥物敏感性實驗使用OMM2.3 shAPOBEC3B和shCtrl 細胞進行，使用CHK1 抑制劑Rabusertib 處理細胞，每隔3 d 進行加藥處理。待長出肉眼可見的克隆后棄去培養液，用PBS 清洗后加入通用型組織固定液（4%PFA）固定15 min。棄去固定液后加入結晶紫染液常溫染色20 min，用清水洗凈后自然晾干，然后用HP Scanjet 5590 掃描儀進行掃描成像。使用Image J 軟件對結果進行統計。

1.2.5 細胞周期分析 收集2×105個shAPOBEC3B及對照shCtrl OMM2.3 細胞，PBS 清洗細胞1 次后使用70%乙醇固定細胞，于4 ℃冰箱固定過夜。固定完成后用冰PBS 清洗，參照試劑盒說明書比例加入核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）以及碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色30 min，流式細胞儀上機分析，得到原始數據后使用Flowjo 軟件分析。

1.2.6 轉錄組測序 本研究中的轉錄組學測序（RNA sequencing，RNA-seq）由北京諾禾致源生物科技公司完成。每組共設置2 個生物學重復。使用Trizol 法從細胞中提取APOBEC3B敲低和對照OMM2.3 細胞總RNA，通過Agilent 2100 Bioanalyzer生物芯片分析系統檢測RNA 完整性和總量，每個樣品約需要1 μg 的總RNA。在轉錄組文庫構建完成并質檢合格后上機測序，對各組樣本進行基因表達水平定量。直接從基因組網站下載參考基因組文件（http：//hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenpath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz）和基因模型注釋文件（https：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.primary_assembly.annotation.gtf.gz），計算每個基因的每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM）值。對差異表達的基因進行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），使用基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、Reactome、人類疾病分類（disease ontology，DO）、基因本體分析生物過程（gene ontology biological process，GOBP） 數據集，將基因按照在2 類樣本中的差異表達程度排序，檢測基因集合的表達變化。使用GraphPad Prism 7.0 軟件繪制差異基因表達熱圖。

1.2.7 實時熒光定量PCR 使用Applied Biosystems?SYBR?Green 預混液配制10 μL PCR 反應體系，使用LightCycler?480 Ⅱ儀器進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR），使用配套軟件進行CT值計算和可視化分析，以甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為對照計算RNA 的表達量。用于qRTPCR的引物序列見表1。

表1 qRT-PCR 檢測相關基因的引物序列Tab 1 Genes and primer sequences used for qRT-PCR analysis

1.2.8 免疫熒光染色 將不同處理組的OMM2.3細胞接種于爬片上，待貼壁完全后進行染色。HU 處理組使用2 mmol/L HU處理細胞4 h后進行染色。用PBS清洗細胞爬片后，用4%甲醛溶液固定爬片15 min，PBS清洗1 次，接著使用0.3%的Triton X-100 溶液對細胞進行通透。用5%BSA 溶液封閉爬片，待封閉完成后用100 μL 磷 酸 化RPA32 （phosphorylated RPA32，p-RPA32）抗體（1∶200 稀釋）4 ℃孵育過夜。PBS洗3 次后加入熒光二抗，常溫孵育1 h，PBS 洗3 次。在載玻片上滴1 滴含DAPI 的抗淬滅封片劑，然后將玻片蓋在載玻片上。使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍攝照片，DAPI 核染色顯示為藍色，p-RPA32 顯示為綠色。

1.2.9 數據庫分析 使用GEPIA 網站（http：//gepia.cancer-pku.cn）完成對癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫中UM 患者的預后分析及各類腫瘤中APOBEC3B基因表達情況分析。

1.3 統計學分析

用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統計學分析。定量資料采用表示。使用非配對t檢驗比較2組之間的差異。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 APOBEC3B 在眼部黑色素瘤中的表達情況以及對患者生存的影響

為檢測APOBEC3B 在眼部黑色素瘤中的表達情況，對眼部黑色素瘤組織進行了IHC 染色（圖1A）。使用APOBEC3B 抗體對福爾馬林固定石蠟包埋的良性痣組織和眼部黑色素瘤組織進行染色。首先，染色結果顯示著色部位大多在細胞核內，這與APOBEC3 B 定位于核內相符合［19］。另外，良性色素痣組織中APOBEC3B 著色很弱，而在眼部黑色素瘤組織中，每個腫瘤組織切片的大部分細胞核中均可檢測到強免疫陽性，說明相對于良性色素痣，眼部黑色素瘤組織中APOBEC3B表達水平更高。

另外，通過GEPIA網站對TCGA數據庫中UM患者總生存時間以及無病生存時間的分析發現，APOBEC3B高表達與UM 患者總生存期縮短相關（P=0.032，圖1B），且與UM 患者的無病生存期顯著縮短相關（P=0.000，圖1C）。對TCGA 數據庫中腫瘤患者APOBEC3B基因表達情況進行分析，結果表明APOBEC3B在大多數的腫瘤組織中高表達（圖1D）。

圖1 APOBEC3B在腫瘤中的表達情況以及對UM患者生存的影響Fig 1 Expression of APOBEC3B in tumors and its effect on UM patient survival

2.2 APOBEC3B 敲低和敲除的OMM2.3細胞系的建立

以RPE細胞作為對照，應用Western blotting檢測UM 細 胞 （92-1、 OMM1、 OMM2.3、 MEL202、MEL270、MEL285、MEL290、MUM2B 和OCM1）、CM 細 胞（CRMM1、 CRMM2 和CM2005.1） 和SKCM 細胞（A375 和A2058）總蛋白表達水平（圖2A）。相較于RPE 細胞，大多數黑色素瘤的細胞系，尤 其 是UM 細 胞 系OMM2.3、 92-1、 MEL202、OMM1、MUM2B 中APOBEC3B 蛋白表達均顯著升高。

為探索APOBEC3B 對UM 的作用機制，選取高表達APOBEC3B 蛋白的UM 細胞系OMM2.3 進行研究，并建立了APOBEC3B敲低和敲除的穩轉細胞系。首先構建了APOBEC3B敲低的慢病毒質粒（shAPOBEC3B）和對照質粒（shCtrl），并將其分別轉染至OMM2.3 細胞中，構建APOBEC3B敲低的OMM2.3 細胞系和對照細胞系；Western blotting 驗證APOBEC3B 蛋白的敲低效率約為63.9%（圖2B）。然后，通過CRISPR-Case9 技術，靶向APOBEC3B基因序列設計APOBEC3B敲除的APOBEC3B-sgRNA 慢病毒質粒。然后將構建好的APOBEC3B敲除質粒sgAPOBEC3B和對照質粒Vector包裝成慢病毒，分別感染OMM2.3 細胞；經單克隆細胞株挑選后，使用Western blotting、基因組DNA 測序驗證成功敲除APOBEC3B的單克隆細胞株（圖2C、D）。結果顯示，與對照未敲除APOBEC3B的OMM2.3 細胞相比，成功敲除APOBEC3B的細胞無對應蛋白表達條帶，且在靶向序列附近檢測到基因編輯。

圖2 APOBEC3B在腫瘤細胞中的表達情況和APOBEC3B敲低和敲除細胞系的構建Fig 2 Expression of APOBEC3B in tumor cells and construction of APOBEC3B knockdown and knockout cell lines

2.3 APOBEC3B的表達對OMM2.3的克隆形成能力和細胞周期的影響

為研究APOBEC3B 表達對OMM2.3 細胞的影響，對sgAPOBEC3B和Vector OMM2.3穩轉細胞系進行克隆形成實驗。在孔板中接種等量細胞數的sgAPOBEC 3B和Vector 細胞，待形成肉眼可見的克隆后進行染色，掃描成像（圖3A）。結果表明，與對照未敲除APOBEC3B的OMM2.3 細 胞 相 比，APOBEC3B敲 除的細胞并未表現出克隆形成數量的顯著改變（P＞0.05，圖3B）。

另外，通過使用流式細胞術，對shAPOBEC3B和shCtrl OMM2.3 細胞進行細胞周期檢測（圖3C）。經統計分析發現，APOBEC3B敲低并未導致細胞周期的顯著改變（圖3D）。這些結果表明，APOBEC3B在OMM2.3中的表達并不影響細胞的克隆形成和細胞周期。

圖3 APOBEC3B的表達對OMM2.3細胞的克隆形成能力和細胞周期的調控Fig 3 Clonogenic ability and cell cycle regulation of OMM2.3 cells by APOBEC3B expression

2.4 APOBEC3B對OMM2.3細胞復制應激相關通路的調控

為進一步探索APOBEC3B 在OMM2.3 細胞中的功能，識別APOBEC3B 下游效應子，對建立好的shAPOBEC3B細胞和對照shCtrl 細胞進行RNA-seq。經檢測，shAPOBEC3B細胞和對照shCtrl 細胞中存在223個差異表達的基因，其中49個基因在APOBEC3B敲低后表達上調，174 個基因表達下調（圖4A）。為研究這些基因的作用通路，通過GSEA 對這些差異基因進行了富集分析，結果表明，差異表達的基因富集到了一些DNA 復制通路（圖4B）。對shAPOBEC3B細胞和對照shCtrl 細胞差異表達的基因進行熱圖分析，結果也表明，APOBEC3B敲低影響了一些復制應激相關通路基因，如增殖細胞核抗原基因（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）等表達的改變（圖4C）。同時，通過RT-qPCR對差異基因進行檢測，驗證了細胞周期蛋白H（cyclin H，CCNH）、黑色素瘤抗應激通路的介質多巴色素互變異構酶（dopachrome tautomerase，DCT）等下游基因表達改變（圖4D）。因此推測，APOBEC3B 可能在DNA 復制過程中通過其催化突變的作用，參與OMM2.3細胞的復制應激過程，從而有可能使其對復制應激通路的靶向藥物敏感。

在shAPOBEC3B細胞和對照shCtrl 細胞中，對復制應激通路關鍵靶標p-RPA32進行免疫熒光染色。結果表明APOBEC3B敲低后p-RPA32 熒光強度明顯降低，并且在HU 誘導復制叉停滯、復制應激通路被激活時，這種現象更為明顯（圖4E）。為研究APOBEC3B 的表達是否會影響OMM2.3 細胞對復制應激通路靶向藥物的敏感性，挑選CHK1 抑制劑對shAPOBEC3B和對照shCtrl OMM2.3 穩轉細胞進行藥物敏感性研究。將相同數量的APOBEC3B敲低及對照OMM2.3細胞系接種于孔板中，待細胞貼壁后對細胞進行CHK1 抑制劑藥物處理，并設置不加藥的DMSO組對照，待形成肉眼可見的細胞克隆后進行結晶紫染色，并掃描成像（圖4F）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y果表明，在1.25 μmol/L 的CHK1 抑制劑處理下，對照組的克隆形成明顯減少（圖4G）。而APOBEC3B敲低組的克隆形成數量雖然也有所減少，但是相較于對照組，克隆數量減少程度相對微弱。這表明與敲低APOBEC3B的OMM2.3 細 胞 相 比，APOBEC3B正 常表達的OMM2.3 細胞對CHK1 抑制劑的處理更為敏感。對照細胞系克隆形成數的減少程度明顯大于APOBEC3B敲低組，證明APOBEC3B 表達使得OMM2.3細胞對CHK1抑制劑更為敏感。

圖4 OMM2.3細胞中APOBEC3B對復制應激相關通路的調控Fig 4 Regulation of replication stress-related pathways by APOBEC3B in OMM2.3 cells

3 討論

由于腫瘤異質性，APOBEC3B 在不同的腫瘤中發揮不同作用。在乳腺癌中，APOBEC3B 高表達腫瘤的突變數量是低表達腫瘤的2 倍；內源性APOBEC3B 蛋白是乳腺癌細胞系提取物中唯一可檢測到的具有將DNA 胞嘧啶突變至尿嘧啶的堿基編輯活性物質的來源［5］。研究［11，20］表明，APOBEC3B 是雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的乳腺癌患者預后不良的生物標志物，且APOBEC3B 誘導的基因異常促進了乳腺癌進展。APOBEC3B 在透明細胞卵巢癌中高表達，且其高表達與預后改善相關［15］。APOBEC3B 表達使腫瘤細胞對順鉑產生的基因毒性作用更為敏感，因此APOBEC3B 可作為預測鉑類化療反應敏感性的候選生物學標志物。APOBEC3B 是胃癌預后獨立危險因素，APOBEC3B 調控胃癌的腫瘤微環境，使表達效應分子和免疫檢查點分子的腫瘤反應性CD8+T 細胞浸潤減少［21］。另外，APOBEC3B還通過誘導S 期阻滯，調控腎上腺皮質癌細胞增殖［22］。而APOBEC3B 在眼部黑色素瘤中的作用尚未見文獻報道。

在本研究中，對TCGA 數據庫的分析結果顯示APOBEC3B在UM 患者中高表達，且顯著影響患者總生存期和無病生存期。在眼部黑色素瘤患者的組織樣本以及細胞系中也分別驗證了APOBEC3B 的高表達，因此推測APOBEC3B 在眼部黑色素發生發展中可能存在著重要功能。文獻［23］報道APOBEC3B 在G2/M期顯著高表達，可能參與調控細胞周期，然而敲除APOBEC3B并未導致OMM2.3 克隆形成能力和細胞周期的顯著改變。APOBEC3B敲低和對照的OMM2.3細胞的RNA-seq 結果顯示APOBEC3B敲低后的差異表達基因并不多，提示APOBEC3B 在UM 中作用機制可能處于相對下游的位置。進一步通過GSEA 分析差異基因發現，在OMM2.3 細胞中，APOBEC3B 參與調控DNA 復制通路。鑒于APOBEC3B 促進腫瘤突變負荷增加的功能［24］，以及APOBEC3B 在乳腺癌中參與復制應激通路作用的相關報道［25］，APOBEC3B可能與OMM2.3 細胞的復制應激過程相關。DNA 復制應激是腫瘤基因組不穩定性的主要來源［26］。APOBEC3B 可通過在DNA 復制叉處誘導無堿基位點，施加復制壓力［27］。在APOBEC3B敲低的OMM2.3 細胞中檢測到復制應激通路關鍵靶標p-RPA32水平的降低。在復制應激通路激活后，RPA32會被活化的共濟失調毛細血管擴張Rad3 相關蛋白（ataxia telangiectasia and Rad3 related protein，ATR）和DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）磷酸化，從而進一步導致CHK1激活和復制停滯［28］。因此，APOBEC3B 的表達可能會使細胞對一些靶向復制應激的藥物敏感，可能作為UM治療的靶標。

在本研究中，使用復制應激通路靶向藥物CHK1抑制劑對APOBEC3B敲低和對照OMM2.3 細胞進行藥物敏感性實驗，結果發現，APOBEC3B 表達的OMM2.3 細胞對CHK1 抑制劑更敏感， 可見APOBEC3B有潛力作為UM 對CHK1抑制劑治療敏感性的生物學標志物。然而，也有研究者認為APOBEC3B 活性只是影響復制應激通路靶向藥物敏感性的一部分因素［27］，其他因素如共濟失調毛細血管擴張突變基因（ataxia telangiectasia-mutated gene，ATM）、p53基因丟失等也可能增加藥物敏感性［29-31］。APOBEC3B 表達活性是否可以用于預測CHK1 靶向治療敏感性，以及是否需要結合其他因素預測治療敏感性，仍需要進一步研究。

總之，APOBEC3B參與OMM2.3細胞復制應激相關通路，有潛力作為評價CHK1抑制劑治療敏感性的生物學標志物，為靶向治療UM提供新的選擇。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究涉及的所有實驗均已通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院研究倫理委員會批準（文件號SH9H-2019-T185-2）。所有實驗過程均遵照《世界醫學大會赫爾辛基宣言》的條例進行。受試對象或其親屬已經簽署知情同意書。

All experimental protocols in this study were reviewed and approved by the Ethics Committee of Shanghai Ninth People's Hospital，Shanghai Jiao Tong University School of Medicine （approval letter No. SH9H-2019-T185-2），and all experimental protocols were carried out by following the guidelines of theWorld Medical Association Declaration of Helsinki. Consent letters have been signed by the research participants or their relatives.

作者貢獻/Authors'Contributions

宗春燕、何杰參與了生物學實驗；張哲參與了數據分析；沈鍵鋒參與了實驗設計；宗春燕、賈仁兵、沈鍵鋒參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The biological experiment was completed by ZONG Chunyan and HE Jie. Data were analyzed by ZHANG Zhe. The study was designed by SHEN Jianfeng.The manuscript was drafted and revised by ZONG Chunyan，JIA Renbing and SHEN Jianfeng. All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2022-03-15

·Accepted：2022-06-25

·Published online：2022-07-25

參·考·文·獻

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