蔪艾精油凝膠緩釋系統的透皮效果評價

蘭曉霞 葛寶健 李瑞欣 錢曉明 曾原

艾是菊科多年生草本植物，主要包括揮發油類、黃酮類、桉葉烷類、三萜類、多糖類和微量元素等多種活性成分[1-2]。據報道，艾葉精油具有鎮痛鎮靜、抗氧化、抗真菌、抗炎、抑菌、抗過敏等藥理作用[3-5]。就不同種類艾草中的精油含量而言，蘄艾中精油含量要比湖南產艾葉精油含量高25%左右[6-7]。臨床用于艾灸的艾條或艾絨在使用過程中會產生和排放大量煙霧，不僅存在燙灼傷、呼吸道刺激、火災等安全隱患，大量煙塵亦使治療環境被污染[8-9]。因此，本研究將蘄艾精油通過低溫3D 打印法制備成凝膠緩釋系統，既可使艾草精油在制備過程中減少揮發，以最大程度避免損失并保持其活性，又能充分利用艾草精油具有抗菌性、促進創面愈合的優點，并且可以克服傳統艾灸存在的安全隱患及污染治療環境等問題。本研究旨在評價不同時間和溫度下，艾草精油凝膠緩釋系統的透皮吸收效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

氣相色譜儀（型號：7890B，美國安捷倫科技公司），火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）（型號：7890A，美國安捷倫科技公司），進樣針（型號：10 μL，美國安捷倫科技公司），色譜柱（柱型號：HP-FFAP，30 mm×0.32 mm×0.25 μm），藥物透皮擴散試驗儀（型號：RYJ-6B，上海黃海藥檢儀器有限公司）。

桉葉油醇（95.0%，分析對照品，CAS：470-82-6，C10H18O，密度0.9225%，上海麥克林生化科技有限公司），無水乙醇（99.5%，藥用級，上海麥克林生化科技有限公司），0.9%氯化鈉生理鹽水（國藥準字：H42020475，規格：0.9%，武漢濱湖雙鶴藥業有限公司），超純水。課題組研制的“一種通過低溫3D 打印法制備的艾草精油凝膠緩釋系統”（已申報發明專利）。

SPF 級12 周SD 雄性大鼠[SCKX（京）2019-0008，北京華阜康生物科技股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 低溫3D 打印蘄艾精油凝膠緩釋系統的制備

將聚乙烯醇溶解于90 ～100℃的水中，配制成聚乙烯醇水溶液，于乳化劑水溶液中混入艾草精油制作成乳化配制混合液，然后將降至常溫的聚乙烯醇水溶液加入上述混合液攪拌均勻，再裝入低溫3D 打印機料筒，進行低溫3D打印，將打印制備的凝膠重復3 ～5 次冷凍和解凍循環后，獲得蘄艾精油凝膠緩釋系統。

1.2.2 皮膚制備

SPF 級12 周SD 雄性大鼠，體質量200 ～260 g，10%水合氯醛腹（0.3 mL/kg）行腹腔麻醉，背部皮膚備皮，保證皮膚完整無破損，剪取腰背部皮膚組織約4 cm2，將取下的皮膚平鋪于干凈的玻璃板上，角質層朝下，剔除多余的皮下結締組織，再用0.9%生理鹽水沖洗干凈，展平后置于低溫冰箱保存備用（-25℃）。實驗前放置于常溫中，自然解凍，并用0.9%生理鹽水浸泡30 min。

1.2.3 析出實驗

將蘄艾精油凝膠緩釋系統分別完全浸沒在5.5 mL 的20%乙醇生理鹽水中，于32℃、35℃、37℃、40℃、42℃，分別恒溫浸泡1、2、3、4 和5 h 后，攪拌均勻后用凍存管分別收集浸泡液50 μL，置于-40℃液氮環境凍存備用。

1.2.4 透皮實驗

采用藥物透皮吸收擴散試驗儀（型號：RYJ-6B，上海黃海藥檢儀器有限公司）進行透皮實驗。剪取3 cm2皮膚組織，按照給藥池、蘄艾精油凝膠緩釋系統、離體大鼠皮膚（角質層一側朝向給藥室）、接收池的順序依次固定。在給藥池和接收池分別加入5.5 mL 的20%乙醇生理鹽水，排空接收池空氣，使蘄艾精油凝膠緩釋系統直接接觸給藥池液體。實驗水浴溫度分別設定為30℃、32℃、35℃、37℃、40℃、42℃，200 r/h 恒速攪拌，每個溫度分別于不同的透皮時間點（1、2、3、4 和5 h）收集接受池液體50 μL，用凍存管封存，置于-40℃液氮中凍存待測。

1.2.5 氣相色譜分析

本實驗以桉葉油醇（95%，分析對照品，CAS：470-82-6，C10H18O）為外標物，定位蘄艾揮發油中桉葉油醇的出峰位置。具體步驟：1）取出凍存液，常溫凍融后充分搖勻進行氣相色譜分析，所有樣品凍存時間不超過48 h，防止蔪艾精油有效成分揮發。2）標準溶液配制：稱取87.5 mg 桉葉油醇標準品，超聲溶解于100 mL 的20%乙醇生理鹽水中，配置濃度為831 μg/mL 標準溶液，氣相色譜分析測定出峰位置并繪制桉葉油醇的面積-濃度標準曲線（圖1）。3）待測樣品中桉葉油醇的峰面積（圖2），根據標準曲線查得樣品中桉葉油醇的濃度（μg/mL）。4）通過對比相同實驗條件下析出浸泡液和接收液中桉葉油醇的含量，分析該條件下蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮率，透皮率=（透皮吸收液中桉油醇的含量/相同溫度相同時間浸泡析出液中桉油醇的含量）×100%。

2 結果

2.1 蘄艾精油凝膠緩釋系統析出實驗

以20%乙醇生理鹽水為溶劑，蘄艾精油凝膠緩釋系統隨著浸泡時間的延長，桉葉油醇的濃度逐漸降低。就浸泡溫度而言，浸泡作用時間相同時，35℃～40℃時蘄艾精油凝膠緩釋系統的桉葉油醇析出效果較佳，尤以37℃浸泡液中桉葉油醇的濃度最高。綜合溫度和浸泡時間，蘄艾精油凝膠緩釋系統于37℃恒溫浸泡2 h 時，浸泡液中桉葉油醇的濃度濃度最高，為18.6 μg/mL（表1、圖3）。蘄艾精油凝膠緩釋系統于37℃恒溫浸泡2 h 的氣相色譜圖譜見圖4。

表1 不同時間和溫度蘄艾精油凝膠緩釋系統浸泡析出液中桉葉油醇的濃度（μg/mL）

2.2 透皮實驗

在藥物透收擴散試驗儀（RYJ-6B）的給藥池和接收池均加入20%乙醇生理鹽水5.5 mL，于32℃、35℃、37℃、40℃、42℃時，恒速200 r/min 分別攪拌1、2、3、4、5 h，收集接收池溶液進行氣相色譜測定，氣相色譜測定結果見（表 2、圖 5）?？梢钥闯鎏I艾精油凝膠緩釋系統接收池中桉葉油醇的濃度在透皮實驗2 h 時濃度最高，之后隨著透皮時間的延長逐漸下降。透皮時間相同時，32 ～37℃時該緩釋系統的透皮接收液中桉葉油醇的濃度逐漸上升，37℃時接收液中桉葉油醇的濃度最高，而隨著溫度的上升，接收液中桉葉油醇的濃度又呈下降趨勢，呈現倒“U”型趨勢。綜合透皮的時間和溫度因素，蘄艾精油凝膠緩釋系統在37℃透皮作用2 h 時，接收液中桉葉油醇的濃度最高，為11.1 μg/mL。該緩釋系統于37℃透皮2 h 時接收池溶液的氣相色譜圖見（圖6）。

表2 蘄艾精油凝膠緩釋系統不同時間和溫度時透皮接收液中桉油醇濃度（μg/mL）

2.3 蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮率

蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮率隨溫度和作用時間的延長，均呈倒“U”型變化。即溫度相同時，隨著透皮作用時間的延長，蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮率從1 h 開始上升，至2 h 透皮率達最高，之后隨著時間的延長透皮效果穩步下降（圖7）；而透皮作用時間相同時，從32℃開始，隨著溫度的升高，藥物透皮率穩步升高，至37℃透皮效果最好，37 ～42℃時，透皮率逐漸下降（圖8）。綜合上述結果，在37℃透皮2 h 時，蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮率可達59.48%，透皮效果最佳（表3）。

表3 蘄艾精油凝膠緩釋系統不同時間和溫度的透皮率（%）

3 討論

3.1 蘄艾精油凝膠緩釋系統

艾是我國傳統中醫藥學常用的草本植物，其中蘄艾是具有代表性的品種之一，植株具有濃烈香氣，全草入藥，有溫經散寒、止血安胎等傳統功效。有研究通過水蒸氣蒸餾法對多個不同產地艾葉進行揮發油提取，發現蘄艾葉的揮發油及桉油精的含量最高[9]。

隨著現代材料科學以及生物學技術的發展，艾草精油的提取技術不斷改進。王曼笛等[10]發現以纖維素納米晶為穩定劑制備的Pickering 乳液對艾草精油有很好的緩釋作用。翟媛媛等[11]以艾草精油為芯材，以明膠、殼聚糖為芯材制備微膠囊，可以讓艾草精油具有良好的緩釋性能。

本研究采用自主研發通過低溫3D 打印法制備精油凝膠緩釋系統，該系統常溫下向空氣中緩慢釋放艾草精油，能夠減少艾草精油在制備過程中揮發造成的損失，在使用過程中消除了傳統艾灸造成的煙霧和的安全隱患，可通過非接觸的方式促進創面愈合，避免了常規水凝膠貼膏劑對創面的刺激。

3.2 氣相色譜的測定條件

本研究蘄艾精油析出液的氣相色譜測定條件為：柱溫60℃，保持2 min，20℃/min 升到120℃，保持3 min，進樣口200℃，檢測器250℃，氮氣流量1 mL/min，氫氣流量40 mL/min，空氣流量400 mL/min，分流比1 ∶1。為了保證測量結果的重復性，每次實驗進樣3 次，每次進樣量為1 μL，取3 次測量結果平均值為最終測定結果。根據相同的色譜條件下峰面積與桉葉油醇含量成正比的原理[12-13]，制訂桉葉油醇的峰面積-濃度標準曲線，該標準曲線的R2=0.998，說明曲線的擬合效果為優。根據待測樣品氣相色譜圖峰面積，由標準曲線計算得出待測樣本中桉葉油醇的濃度。

3.3 蘄艾精油凝膠緩釋系統透皮效果

艾灸藥理主要通過藥物、溫熱與近紅外光輻射發揮作用[14-15]。本研究主要研究32℃、35℃、37℃、40℃、42℃5 個較高溫度下，蘄艾精油凝膠緩釋系統的精油成分透皮吸收效果。朱乃甫等[14]發現艾葉精油的透皮吸收效果在透皮作用時間相同時，隨著溫度的升高，艾葉精油的透皮率大大增加；而溫度固定時，透皮作用時間越長，艾葉精油的透皮率越高。其作用機制主要與分子熱運動增加、皮膚通道打開、局部血管擴張有關。本研究選擇浸泡時間和透皮作用時間分別為1、2、3、4、5 h 時間點來分析蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮效果。結果顯示，蘄艾精油凝膠緩釋系統的透皮率在同一溫度下隨著透皮時間的變化呈先上升后下降的趨勢，在同樣透皮時間下，隨著水浴溫度的升高也呈現先上升后下降的趨勢。這與前期研究結論存在差異[14]。這可能是因為在艾葉精油含量一定的情況下，其透皮釋放過程是存在峰值變化的，如果持續增加精油的含量來研究溫度和時間對艾葉精油透皮作用的影響，其結論是與前期研究相符的[14]。尹彬彬[15]研究艾葉精油的提取實驗發現，浸泡時間與艾葉精油得量呈現先下降后逐漸上升然后下降的趨勢，認為增加浸泡時間并不能有效提高精油含量隨著析出量的增加，艾草中的精油含量降低，這與本研究結論一致。所以，在艾葉精油含量固定的情況下，綜合透皮作用時間和溫度因素，本課題組研發的蘄艾精油凝膠緩釋系統在37℃、透皮2 h 時藥物透皮率最大，透皮吸收效果最佳，建議臨床應用時，按時更換蘄艾精油凝膠緩釋系統，以保證艾葉精油的持續性和高透過作用。

3.4 本研究的應用前景

現有研究認為，高溫促進蘄艾精油的透皮吸收主要有三種機制：1）分子的熱運動速度隨著溫度的升高而增快，利于促進精油成分的運動過程。2）皮膚通道間隙隨著溫度提高可以增加、變大，皮膚的滲透性能增強。3）局部的皮下組織血管隨著溫度升高發生擴張，血液循環有效加快，促進藥物吸收。本研究證實了溫度和時間因素對蘄艾精油凝膠緩釋系統透皮率的影響，表面溫度、時間與艾草精油透皮率均呈倒“U”型變化，證實蘄艾精油凝膠緩釋系統在臨床透皮應用的最佳溫度是37℃，最佳作用時間是2 h。

本研究雖然事先評估了凍存液存放時間對桉葉油醇檢測量的影響，確定了凍存液的氣相色譜檢測時間不超過48 h。但由于樣品中桉葉油醇的痕量特點，建議盡可能選擇新鮮的接收液或浸泡液進行氣相色譜檢測，進一步提高結果的準確性。

本實驗通過將蘄艾精油凝膠緩釋系統浸泡于20%乙醇生理鹽水中，研究32℃、35℃、37℃、40℃、42℃，分別恒溫浸泡1、2、3、4、5 h 后的析出率，然后用SPF 大鼠模擬人體皮膚，研究蘄艾精油凝膠緩釋系統在不同溫度的透皮率，該實驗條件與臨床實用場景相近，便于將基于本緩釋系統的產品直接應用于臨床實驗研究。本課題組研制的蘄艾精油凝膠緩釋系統可在常溫下向空氣中釋放艾草精油，但本研究在研究透皮率時，未評估向空氣釋放后蘄艾精油凝膠緩釋系統精油含量的衰減。

本研究前期實驗觀察到本緩釋系統可以通過非接觸促進創面或者感染創面的愈合，提示下一步可研究緩釋系統通過非接觸促進創面或者感染創面愈合的效果，綜合分析緩釋系統的最佳使用條件。