人參皂甙-Rb1 通過促進神經元線粒體自噬治療大鼠創傷性顱腦損傷的機制

鄒樹峰 姜碧霞 馮九庚 陳偉，2

1.南昌大學第一附屬醫院 南昌 330008 2.同濟大學附屬上海東方醫院（上海市浦東新區人民醫院）

隨著社會經濟水平的提高，建筑業和交通工具的高速發展，創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）患者數量持續升高。TBI急性期出現的神經炎癥反應導致的神經元損傷，是造成患者致殘的重要因素之一[1]。線粒體損傷是炎癥產生的重要原因之一，而人參皂甙中最主要的成分人參皂甙-Rb1（ginsenoside-Rb1，GS-Rb1）具有抑制損傷后炎癥的作用[2-3]。線粒體自噬是細胞特異性清除體內受損線粒體，緩解凋亡通路激活的保護性反應。前期研究顯示，GS-Rb1在神經系統損傷后具有抑制縫隙連接40（Connexin40，Cx40）蛋白，進而拮抗氧化應激的作用[4-5]；研究還發現，TBI后Cx40的代謝與自噬相關[6]。這些結果提示，GS-Rb1的細胞保護效應很可能與線粒體自噬相關。本研究通過對線粒體自噬功能的調控，研究TBI后GS-Rb1神經元保護的具體途徑，旨在探討GS-Rb1對TBI治療作用的具體機制，并為相關臨床治療奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠80只，體質量350～400 g，由南昌大學實驗動物中心提供[實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2020-0001]。實驗期間以固體平衡飼料飼養，自由飲水，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%。本研究經南昌大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（批準號：南昌大學第一附屬醫院醫研倫2019年第41號）。

1.2 試劑及儀器 GS-Rb1購于上海邦景實業公司（批號：41753-43-9）；細胞自噬阻斷劑6-氨基-3-甲基嘌呤（3-methyladenine，3-MA）購于南京沃博生物科技有限公司（批號：5142-23-4）；小鼠多克隆抗體神經元自噬相關輕鏈蛋白3-Ⅱ/輕鏈蛋白3-Ⅰ（light chain 3-Ⅱ/light chain 3-Ⅰ，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ）、自噬接頭蛋白（sequestosome-1，P62）、線粒體功能相關蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活子-1 alpha（peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-1 alpha，PGC-1α）、線粒體外膜轉位蛋白20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOM20）及凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤-2基因相關X蛋白（B cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、裂解的半胱天冬酶3（cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase 3）均購于美國Abcam公司（批號：192890、207305、182733、32042、145641、214532）；辣根酶標記二抗購于北京博奧龍免疫技術有限公司（批號：KLB124154）；化學發光試劑盒購于北京中杉金橋生物科技有限公司（批號：3605071）；超氧物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司（批號：2190523、20211119、20180523）。PowerPacTMBasic型蛋白垂直電泳儀購于美國Bio-Rad公司；L8型UV762紫外光分光光度計為上海第三分析儀器廠產品。

1.3 動物模型制作 采用液壓打擊制作大鼠TBI模型。大鼠予異氟烷吸入持續麻醉，固定于立體實驗臺，常規消毒鋪巾，于頭部正中分層切開皮膚和骨膜，暴露右側頂骨，于矢狀縫旁3 mm，冠狀縫后3.5 mm處，以開顱磨鉆鉆骨孔，暴露硬腦膜，于骨孔處放置與骨孔大小相同的小帽，固定液壓管后，施行3個大氣壓（重型顱腦損傷標準）的液壓擊打。

1.4 分組及藥物干預 80只SD大鼠被隨機分為假手術組、TBI組、治療（TBI+GS-Rb1）組、自噬阻斷（TBI+GS-Rb1+3-MA）組。假手術組僅暴露硬腦膜而不進行擊打，TBI組僅建模不予藥物處理，治療組和自噬阻斷組采用液壓擊打建立TBI模型[7-8]，按照前期實驗方法，1 h后分別腹腔注射GS-Rb1（40 mg/kg）及GS-Rb1（40 mg/kg）+3-MA（30 mg/kg）[5-6]，GS-Rb1以0.9%氯化鈉溶液溶解。建模后48 h進行后續指標檢測，每組取10只大鼠進行行為學檢測，其余10只行其他檢測。根據預實驗及前期實驗顯示，為獲得P值在0.05水平，1-β在0.20水平，根據Effect-Size計算出所需的每組動物數量為8（G-Power3.0），本研究為防止大鼠意外死亡引起樣本量的不足，故各組樣本量確定為10只。

1.5 大鼠神經損傷嚴重程度評分（neurological severity score，NSS）采用雙盲法，具體方法如下：a.提鼠尾離地面約30 cm，觀察前肢情況，正常大鼠兩前肢對稱地伸向地面，有左肩內旋，左前肢內收者，評為4分，否則評為0分。b.將動物置于平滑地板上，分別推左（或右）肩向對側移動，檢查抵抗運動的阻力。正常大鼠兩側阻力明顯對稱，右肩向左側移動阻力下降時，根據下降程度的不同，評為0～3分。0分：雙側抵抗等同，正常；1分：左側抵抗輕度下降；2分：左側抵抗中度下降；3分：左側抵抗力消失。c.將動物兩前肢置于金屬網上，觀察兩前肢的張力，正常大鼠兩前肢張力明顯對稱，發現左前肢肌張力下降者，根據下降程度的輕重，評為0～3分。0分：正常；1分：肌力下降，但能抬離平面；2分：癱瘓，無法抬離平面，只能水平運動；3分：無任何活動。根據以上評分，滿分10分，分數越高，說明動物的行為障礙越嚴重[7-8]。

1.6 蘇木精-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色觀察神經元病理學改變 取損傷處海驅皮質組織標本，經包埋、切片、脫蠟、水化，使用蘇木精染色5 min后以自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min后以伊紅染色2 min，梯度乙醇脫水，中性樹脂封片，光鏡下觀察并拍照。

1.7 免疫印跡法檢測神經元線粒體結構/功能相關蛋白表達 取損傷側海馬區皮質組織，裂解后提取總蛋白并定量，根據目標蛋白分子量不同，選擇不同濃度的十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，常規方法轉印至硝酸纖維素膜上，封閉2 h后分別加入相應一抗anti-LC3-B（稀釋比例：1∶1 000）、anti-P62（稀釋比例：1∶1 500）、anti-PGC-1α（稀釋比例：1∶1 000）、TOM20（稀釋比例：1∶1 000）、anti-cleaved caspase 3（稀釋比例：1∶1 000）、anti-Bax（稀釋比例：1∶1 000），以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，一抗anti-GAPDH（稀釋比例：1∶2 500）。4 ℃孵育過夜，洗滌后加入相應辣根過氧化物標記的二抗孵育，化學顯影，掃描蛋白條帶，采用Image J 1.36b軟件進行分析。蛋白相對表達量以目標蛋白吸光度值/GAPDH吸光度值表示，以假手術組目標蛋白/GAPDH為100%，其余組與之進行比較。

1.8 氧化應激相關因子檢測 取大鼠損傷側海馬區皮質組織，洗滌后充分勻漿，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清液，分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫酸代巴比妥法、二硫代硝基苯甲酸縮合法，分別檢測SOD活性、MDA及GSH水平，以假手術組為100%，其余組與之比較。

1.9 統計學分析 使用SPSS 22.0和Graph Prism統計軟件進行統計學分析。符合正態分布的連續型變量以表示，多組間比較采用方差分析，其中任意兩組間比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠NSS評分比較 與假手術組比較，TBI組NSS升高；與TBI組比較，治療組的NSS明顯降低（P＜0.05）。當采用自噬抑制劑3-MA后，可明顯阻斷GS-Rb1的神經功能保護作用（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠NSS比較Fig.1 Comparison of NSS in each group

2.2 各組大鼠神經元形態學比較 假手術組大鼠神經元形態正常，輪廓清晰，圓潤飽滿，細胞核位于中央。TBI組損傷處神經元萎縮，輪廓不清，組織紋理紊亂。治療組的神經元受損程度明顯緩解。采用自噬抑制劑3-MA后，可明顯阻斷GS-Rb1對神經元形態保護作用。見圖2。

圖2 各組大鼠海馬神經元病理病理形態學觀察（HE染色，200×）Fig.2 Pathological changes of hippocampal neuron in each group（HE staining，200×）

2.3 各組大鼠神經元自噬相關蛋白表達比較 與假手術組比較，TBI組自噬明顯受到抑制（P＜0.05）。與TBI組比較，其余兩組干預后自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例明顯升高，P62表達明顯降低（P＜0.05），證明GS-Rb1能夠增強自噬。自噬抑制劑3-MA則可明顯抑制自噬蛋白的表達及自噬反應（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠自噬相關蛋白表達比較Fig.3 Comparison of autophagy related protein expression in each group

2.4 各組大鼠神經元線粒體形態/功能相關蛋白表達比較 與假手術組比較，TBI組神經元線粒體相關蛋白PGC-1α及TOM20明顯下調（P＜0.05），而GS-Rb1可明顯上調損傷后神經元PGC-1α及TOM20的表達（P＜0.05），自噬抑制劑3-MA可明顯抑制同時此種效應（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠PGC-1α和TOM20蛋白表達比較Fig.4 Comparison of PGC-1α and TOM20 protein expression in each group

2.5 各組大鼠神經元凋亡比較 與假手術組比較，TBI組凋亡相關蛋白Bax及cleaved-caspase 3表達明顯升高（P＜0.05）。與TBI組比較，GS-Rb1可明顯降低促凋亡蛋白Bax及cleaved-caspase 3表達（P＜0.05）。當給予自噬抑制劑3-MA后，則可明顯抑制此種效應（P＜0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠凋亡相關蛋白表達比較Fig.5 Comparison of apoptosis related protein expression in each group

2.6 各組大鼠神經元氧化應激反應比較 與假手術組比較，TBI組SOD活性及GSH水平降低，而MDA水平明顯升高（P＜0.05）。與TBI組比較，治療組MDA水平降低，GSH水平升高，SOD活性升高（P＜0.05）。自噬抑制劑3-MA可明顯阻斷GS-Rb1抑制氧化應激的效應（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組大鼠SOD、GSH及MDA表達比較Fig.6 Comparison of SOD，GSH and MDA expression in each group

3 討論

TBI的發病機制較為復雜，目前認為氧化應激因子的激活可能與腦損傷密切相關[9]。前期研究發現，TBI后Cx40蛋白的異常表達和氧化應激因子的表達密切相關[4]，而氧化應激的產生則與線粒體-內質網系統功能紊亂相關。因此筆者推測，線粒體-內質網系統功能保護可能在TBI的治療中具有重要的作用。

人參皂甙（ginsenoside，GS）是人參最主要的活性成分。研究證明，GS具有抗炎、抗氧化及降低脂質代謝產物的作用[10]。Rb1作為GS中含量最多的成分，受到越來越多的重視。前期研究發現，GS-Rb1在腦缺血再灌注損傷后可抑制氧化應激因子尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 1，NOX1）、NOX2、NOX4及炎癥因子白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的表達，并上調細胞骨架蛋白緊密連接蛋白-1（zonula occluden-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）的表達，具有神經功能保護作用[11]。研究顯示，GS-Rb1可能通過降低Cx40的表達，抑制TBI后的氧化應激[4-5，12]，但尚未對其中具體機制進行深入分析，仍需要進一步明確GS-Rb1參與抑制氧化應激的具體途徑。

自噬作為真核生物細胞的重要代謝途徑，能夠降解一些錯構的蛋白質以及受損的細胞器，對維持細胞穩態起著重要的作用。線粒體自噬是目前研究較多的一種自噬形式，是選擇性清除受損線粒體的過程。線粒體被稱為細胞的“Power house”，參與了細胞的各種生物過程，包括三磷酸腺苷產生、鈣穩態、細胞凋亡及活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生，因此線粒體損傷影響巨大，受損的線粒體可導致細胞凋亡，增強氧化應激損傷[13]。研究顯示，自噬早于凋亡的出現，并可通過清除受損的線粒體而抑制凋亡[14]。近年來筆者團隊的研究也證實，自噬可清除氧化應激的促進因子Cx40[6]。以上均提示，線粒體自噬可能通過抑制氧化應激下游的炎性產物增多，從而起到細胞保護作用。本研究中，GS-Rb1可明顯上調神經元LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例、下調P62的表達，說明整個自噬過程通暢，也證明GS-Rb1與自噬的誘導相關。進一步觀察到，線粒體功能/結構蛋白PGC-1α、TOM20表達均明顯上調，這提示線粒體的功能及數量得到明顯保護。繼續觀察下游凋亡途徑時發現，凋亡促進因子Bax及cleaved-caspase 3表達也較TBI組明顯降低，使用自噬抑制劑時可明顯阻斷GS-Rb1的效應。這均說明，GS-Rb1的神經元保護效應與線粒體自噬的激活直接相關。

氧化應激可能與線粒體-內質網功能損傷后ROS增多密切相關。本研究證實，GS-Rb1在增強自噬的基礎上，也可以明顯降低氧化應激因子MDA水平，并可升高抗氧化應激因子GSH的水平及SOD的活性。而使用自噬抑制劑后，可逆轉GS-Rb1抗氧化應激損傷的作用。形態學觀察也證實，自噬抑制劑可明顯降低GS-Rb1對神經功能及神經元形態的保護作用。以上的研究結果均證實，GS-Rb1對受損神經元功能及形態的保護作用與誘導線粒體自噬、緩解氧化應激損傷有關。

綜上所述，本研究說明TBI后GS-Rb1對神經元的保護效應可能與線粒體自噬的激活、線粒體功能的保護，以及對凋亡及氧化應激的抑制有關。在此基礎上，將進一步研究GS-Rb1對自噬相關基因及信號傳導通路的影響，為了解GS-Rb1的細胞保護機制及TBI的治療奠定基礎。