基于高通量測序對絕經后骨質疏松癥腎陰虛證中基因差異表達的研究

方莉萍 姜丹生 林樹梁 吳俊琪 王金華 浮苗

金華市中心醫院 浙江，金華 321000

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種多因素的慢性疾病，主要病因是女性絕經后卵巢功能低下，導致雌激素不足，骨量丟失過快、骨脆性明顯升高，其最嚴重的并發癥即骨質疏松性骨折，是全球關注的一個健康問題[1]。臨床腎虛常見腎陰虛和腎陽虛，PMOP以腎陰虛證為主[2]?！白C”是機體在各種致病因素影響下所發生的綜合表現，包括整體體質反應特點及整體與外在環境之間、臟腑經絡之間、細胞之間、細胞與體液之間的相互關系[3-4]。研究發現，細胞之間的通訊是通過被膜包裹的小囊泡顆粒（稱為外泌體）介導的，它能夠與循環途徑中周圍細胞的細胞膜發生融合，釋放其所含的蛋白質、DNA和RNA等，進而激活靶細胞內的信號通路[5]。骨髓中的間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨再生的種子細胞，對維持正常骨代謝功能起到重要作用。BMSCs來源的外泌體在多種生理條件下更穩定，無免疫原性，因此更適合于多種疾病的治療[6]。

BMSCs外泌體的特性使得它成為目前的研究熱點，但其在PMOP腎虛癥中的研究甚少。本研究在證候理論指導下，結合基于整體思維的系統生物學方法，探索PMOP腎陰虛證BMSCs外泌體差異基因表達變化，從分子水平尋找臨床防治PMOP腎陰虛證的關鍵基因及基因調控途徑，為PMOP腎陰虛證的機制研究提供新的見解。

1 材料和方法

1.1 研究對象 以金華市中心醫院關節外科2019年7月至2021年6月收治的股骨頭壞死或股骨頸骨折患者為對象。在人工股骨頭置換及全髖關節置換手術過程中，從股骨骨髓腔中抽取骨髓和血液，分離培養BMSCs。檢測肝腎功能、血尿常規、心電圖和B超等，以雙能X線骨密度儀檢測正位腰椎L1-4和左側股骨上端骨密度，聯合中醫辨證，共選擇40例患者，其中20例被診斷為PMOP腎陰虛證，20例為骨量正常對照組。納入標準：（1）骨質疏松診斷參照世界衛生組織PMOP的診斷標準[7]，中醫證候診斷標準參照文獻[8]；（2）無服用可能影響骨骼或鈣磷代謝的藥物史；（3）無影響骨代謝的全身性疾??；（4）無血液系統疾病及骨腫瘤等疾??；（5）所有參與研究的患者均知情同意，并簽署知情同意書。排除標準：（1）不符合骨質疏松癥診斷及中醫腎陰虛證辨證標準者；（2）因類風濕性關節炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進等繼發骨質疏松癥者；（3）合并心腦血管嚴重疾病，合并肝、腎功能檢查異常者；（4）最近1個月用過中藥治療骨質疏松癥者，或近3個月內行激素替代治療或使用降鈣素者，或近6個月內有連續15 d以雙膦酸鹽等防治骨質疏松癥者。本研究已獲得金華市中心醫院倫理委員會的倫理批準（2020-255-001）。

1.2 主要試劑和儀器 外泌體RNA分離試劑盒購于加拿大Norgen 有限公司（批號：25700）；TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESIS Kit 逆轉錄試劑盒、SYBR green qPCR mix試劑盒均購于成都丹鳳科技有限公司（批號：K1622、K0521）。NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀為美國Thermo Scientific有限公司產品；Agilent Bioanalyzer 2100 生物分析儀購于美國Agilent Technologies有限公司。

1.3 BMSCs分離培養及其外泌體提取鑒定 采用全骨髓培養法體外分離培養BMSCs，并鑒定其成脂和成骨分化能力，以流式細胞術檢測BMSCs細胞表型。取PMOP組及骨量正常對照組BMSCs第三代細胞培養上清液30 mL，以試劑盒提取外泌體。為了驗證外泌體提取的效果，通過免疫印跡法鑒定其標記蛋白CD9、CD63和CD81，并用透射電鏡分析外泌體的超微結構，具體方法結果參考本課題組前期研究[9]。

1.4 外泌體RNA提取及基因芯片mRNA表達譜 隨機從兩組各取3例患者的BMSCs外泌體，分別命名為PMOP 1～3和C1～3，使用外泌體RNA分離試劑盒提取BMSCs外泌體總RNA，利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度儀定量并經Agilent Bioanalyzer 2100生物分析儀檢測RNA完整性，送至杭州聯川生物技術股份有限公司進行高通量測序分析。

1.5 mRNA功能組分析 對標準化后的數據進行后續分析，利用P值和倍數變化值進行差異基因篩選，篩選標準為：P≤0.05，且上調或者下調倍數變化值≥1.5。差異表達mRNA的聚類分析中選取P值最小的top 200繪制聚類圖。以log2（倍數變化值）為橫坐標，-log10（P值）為縱坐標，對差異表達分析中所有的基因繪制火山圖。通過基因本體分析（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，預測差異表達mRNA的生物學功能。

1.6 定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)驗證分析 為驗證基因芯片結果的可靠性，提取20例PMOP腎陰虛證組和20例骨量正常對照組患者的BMSCs外泌體RNA，對部分差異表達的mRNA進行RT-qPCR驗證。按照說明書使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，隨后采用SYBR green qPCR mix試劑盒進行RT-qPCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參基因。mRNA的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算，引物由杭州聯川生物技術股份有限公司設計，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結果

2.1 受試者一般資料分析 本研究共納入絕經后女性40例，其中PMOP腎陰虛組20例，骨量正常對照組20例。見表2。隨機從兩組各取3例患者，分別命名為PMOP 1～3和C1～3，進行高通量測序分析。見表3。

表2 受試者一般資料比較Tab.2 Comparison of subjects' general data（）

表2 受試者一般資料比較Tab.2 Comparison of subjects' general data（）

注：BMI：體質量指數；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。Note: BMI: body mass index;TC: total cholesterol;TG: triglyceride;HDL-C: high density lipoprotein cholesterol;LDL-C: low density lipoprotein cholesterol.

表3 測序組患者一般資料比較Tab.3 Comparison of general data in sequencing group

2.2 兩組患者BMSCs外泌體中mRNA的差異分析 比較兩組患者BMSCs外泌體中mRNA表達譜，將差異表達的標準化數據制作成熱圖。見圖1a。如果兩組中mRNA水平至少相差1.5倍，則認為其表達存在差異（P≤0.05）。兩組BMSCs外泌體鑒定出174個差異表達的mRNA，其中92個上調，82個下調。見圖1b?；蛐酒Y選的前10個顯著上調和前10個顯著下調的mRNA見表4。在mRNA失調的轉錄物中，甲狀腺轉錄因子1（thyroid transcription factor 1，TTF1）上調最多，log2（倍數變化值）為2.22，而γ-氨基丁酸受體相關蛋白1（γ-aminobutyric acid receptor associated protein like 1，GABARAPL1）的下調程度最大，log2（倍數變化值）為-2.18。

表4 基因芯片結果中上調和下調前10位mRNATab.4 Top 10 mRNA up-regulated and down-regulated in microarray results

圖1 兩組患者BMSCs外泌體中mRNA表達譜Fig.1 mRNA expression profiles in exosomes of BMSC in two groups

2.3 RT-qPCR驗證差異表達mRNA 為驗證基因芯片測序結果，選取10個mRNA（P≤0.05，倍數變化值≥2）進行RT-qPCR驗證。10個mRNA中4個上調（ATM、MAX、THBS3和WWTR1），6個下調（COL8A1、GABARAPL1、HLA-DQA1、HSPA1L、PPP2R2D和PTHLH）。為了確定這些mRNA在BMSCs外泌體中的表達水平，對20例PMOP腎陰虛證組和20例骨量正常對照組進行驗證。10個mRNA的表達譜與基因芯片檢測結果均一致。見圖2。兩組間ATM、COL8A1、GABARAPL1、HLA-DQA1、HSPA1L、MAX、PPP2R2D、PTHLH和WWTR1的表達水平差異有統計學意義（P＜0.001）。

圖2 兩組患者mRNA的RT-qPCR驗證Fig.2 RT-qPCR verification of mRNA in two groups

2.4 差異表達mRNA功能分析 對差異表達mRNA的進行GO功能分析和KEGG通路富集分析。GO功能分析結果顯示，分子功能主要集中在DNA、RNA和蛋白質的結合；生物功能主要集中在細胞和蛋白質運輸、骨成熟參與、骨小梁形成、鈣離子結合方面；細胞功能主要集中在細胞核、細胞膜和線粒體中。見圖3a。KEGG富集結果顯示，差異mRNA在參與成骨分化的信號通路如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、自噬調節、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B，PI3K-AKT）、鈣離子信號通路、雌激素信號通路和叉頭框轉錄因子O（forkhead box transcription factor O，FoxO）亞族信號通路富集。見圖3b。

圖3 功能富集分析Fig.3 Functional enrichment analysis

3 討論

PMOP是一種多因素慢性疾病，隨著老年人口的增加，骨質疏松癥的發病率呈上升趨勢，PMOP成為了一個全球關注的健康問題[10]。由于缺乏有效的治療方法，探索PMOP的發病機制和尋找新的治療策略一直是PMOP研究的重要目標?！罢闩芍嗅t”骨傷學家肖魯偉發現中醫理論中的“髓”的概念與現代醫學的干細胞及其組織微環境在生物學上存在著高度相似性，將干細胞及其微環境功能紊亂引起骨與關節病損的骨傷疾病定義為“髓系骨病”，特別是對股骨頭壞死、骨質疏松癥、骨性關節炎，提出了髓系骨病的“腎虛髓萎”的病因病機學說[11]。本研究選擇了PMOP腎陰虛證組與骨量正常對照組的BMSCs，然后對其微環境外泌體內的差異表達基因進行分析，通過基因芯片獲得了174個差異表達基因，其中92個上調，82個下調；RT-qPCR鑒定出的9個關鍵mRNA（ATM、COL8A1、GABARAPL1、HLA-DQA1、HSPA1L、MAX、PPP2R2D、PTHLH和WWTR1）與基因芯片數據一致，且在兩組間差異有統計學意義。

基于功能注釋分析，本研究發現MAPK和自噬調節是PMOP腎陰虛證組中差異表達基因顯著富集的通路。有研究報道，MAPK信號通路在調節成骨分化中起著至關重要的作用[12]。MAPK信號通路是缺氧觸發的核心調控通路，缺氧影響MSCs的細胞周期、增殖、凋亡、遷移和分化[13]。通過對HSPA1L進行調節，可保護MSCs免受凋亡衰老的影響[14]。最近研究表明，自噬與骨代謝疾病的發病機制具有相關性，包括骨硬化癥、Paget骨病和PMOP[15-17]。自噬可以抵抗衰老過程中的氧化應激反應，在PMOP 中起著重要作用[18]。GABARAPL1是一個與自噬相關的重要基因[19]，本研究提示其在PMOP腎陰虛證組下調最明顯。有研究證實，GABARAPL1存在于分泌型外泌體的外膜上，使用抗體封閉GABARAPL1 可導致外泌體的功能抑制，這使GABARAPL1可能成為疾病治療的一個新靶點[20]。因此，筆者推測GABARAPL可能成為PMOP腎陰虛證的一個非常有意義的治療靶點。

有學者利用藥理學方法來預測傳統中藥四物湯的活性化合物和潛在靶標，發現參與的信號通路有PI3K-AKT信號通路、MAPK信號通路和FoxO信號通路，四物湯可以通過干預與骨質疏松癥發展有關的生物學過程和信號傳導通路起到治療骨質疏松癥的效果[21]。PI3K-AKT信號通路可促進成骨細胞增殖、分化和成骨，從而抑制骨質疏松癥[22]。本研究結果提示，PPP2R2D、THBS3和CDC37參與PI3K-AKT信號通路，這些基因可能與PMOP腎陰虛證發生相關。本研究還發現，ATM基因參與FoxO信號通路，它是細胞氧化防御的關鍵調節因子，也是一種參與DNA損傷反應的應激酶，是保持基因組完整性和干細胞更新所必需的，在調節成骨細胞特異性轉錄因子osterix的表達中起積極作用，正向調節成骨細胞分化和骨形成[23-24]。COL8A1是膠原蛋白，在骨質流失和骨質疏松癥的發病機制中起著核心作用[25]。研究發現，軟骨內骨化途徑中的關鍵基因PTHLH，與漢族女性PMOP有關[26]。

總之，本研究利用基因芯片篩選出PMOP腎陰虛證患者BMSCs外泌體相關的mRNA及其參與的信號通路，這些差異表達的mRNA是否可以成為PMOP腎陰虛證特異的mRNA，需要進一步驗證。本研究仍有不足之處，收集的病例均為股骨頭壞死或股骨頸骨折患者，可能造成選擇性偏倚，亟待在后期研究中改進。然而，本研究可能是較早應用高通量測序技術篩選PMOP腎陰虛證BMSCs外泌體相關mRNA的研究，篩選出的9個關鍵mRNA可能作為PMOP腎陰虛證患者的特異性診斷及預后靶點，為中醫“證”實質的研究提供了新的突破口。