實驗動物飼料標準化工作現狀及發展探討

羅建波,李軍暉,周 佳,何 勇,付 敏

(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院實驗動物研究所,成都 610212;2.四川省畜牧科學研究院,成都 610066)

動物實驗是進行醫學研究的重要手段，在生物醫藥行業的發展中發揮巨大作用。為減少動物實驗過程中的變量，保證實驗結果的科學性，實驗動物標準化具有重要意義［1］，實驗動物標準化是由實驗動物生產條件標準化、動物質量的標準化及動物實驗條件的標準化組成。標準化的實質是在產品質量、品種規格、生產條件等方面形成統一技術標準，力求動物試驗結果具有均一性、可重復性及可比性。實驗動物的各項生理功能都與飼料營養直接有關，因此標準化的實驗動物飼料是培育和生產出標準化實驗動物的前提［2］。為此，本文根據實驗動物飼料研究現狀，對當前實驗動物飼料標準化情況進行綜述，以期為國內實驗動物飼料標準化進程提供參考。

1 實驗動物飼料分類、特點及標準化內容

根據飼料原料類型和特點，實驗動物飼料可分為配合飼料、純化日糧和化學合成飼料［2］。用農產品及其副產品配制的飼料被稱為配合飼料，如全谷物（如玉米粉、小麥粉）、農作物副產品（如麥麩、玉米面）、高蛋白食物（如豆粕、魚粉）、開采或加工礦物質（如石灰石、骨粉）和家畜飼料成分（如豆餅、苜蓿粉）等。因其適口性強，成本相對低廉，加工工藝易于實現，因此，配合飼料被廣泛應用于國內實驗動物領域，然而配合飼料原料中的營養物質含量易受土壤結構、天氣條件、化肥使用、收割和儲存方式以及加工或研磨方法等因素影響，因此，配合飼料原料的優劣直接決定實驗動物飼料的質量和達到飼料標準化的難度［3］。

營養物質均由化學合成或提純的物質組成，一種原料提供一種營養素的日糧被稱為純化日糧。飼料成分包括酪蛋白和大豆蛋白分離物（作為蛋白質源）、糖和淀粉（作為碳水化合物源）、植物油和豬油（作為脂肪和必需脂肪酸源）、化學提取的纖維素（作為纖維源）以及化學純無機鹽和維生素（作為微量元素和維生素源）。對于必須嚴格控制營養濃度和特定成分的課題研究，日糧的配置需要采用最基本的營養元素單元，如單個氨基酸、特定的糖、必需脂肪酸、無機鹽和維生素等，這種日糧被稱為化學合成飼料［3］。純化日糧和化學合成飼料因其具有配方認可度高、原料營養濃度變化小、加工制作可重復性強等優點，在國內外科研領域擁有極高的認可度，但是其原料特性導致純化日糧和化學限定飲食適口性差，生產成本高，加工工藝復雜［3］，國內少數生產企業能達到高標準的生產條件，且各企業之間產品層次差距較大。綜上，配合飼料所具備的成本相對低廉，加工方式簡單，營養均衡全面、適口性好等優點，導致其在實驗動物飼料使用量上占據明顯優勢。而純化日糧和化學合成飼料因其原材料均為提純化合物，一種原料提供一種營養素，配方公開透明，可重復性高，在國內外科研領域擁有較高的認可度，但純化日糧和化學合成飼料的配方原料特性導致飼料生產成本和加工工藝要求遠高于配合飼料，限制了其適用范圍。

實驗動物飼料標準化的主要內容包括配合飼料、純化日糧和化學合成飼料在原料、配方參數、加工流程、包裝工藝、滅菌方式、存放條件、營養成分和質量控制標準化［4］。未能實現標準化的實驗動物飼料，由于整個飼料加工流程變量因素多，可變范圍較大，因此所獲得的動物試驗數據相對標準化實驗動物飼料缺乏準確性和說服力，因此，只有形成實驗動物飼料標準化實施路徑，才能確保標準化實驗動物和標準化動物實驗的順利進行和良性發展［5］。

2 國際實驗動物飼料標準化工作現狀

1940年，歐美發達國家就開始著手研制實驗動物標準化日糧，并在1960年形成了以谷物類原料作為基礎的實驗動物天然飲食配方，由于上述配方中過度缺乏維生素和礦物質元素，在實驗動物營養學、毒理學、腫瘤學和行為學研究中，實驗結果重復性較差，常導致實驗得出錯誤結論。因此，1970年代初期，為滿足大、小鼠對營養物質的需求，美國國立衛生研究院（National Institutes of Health，NIH）制定了第一個“實驗動物配合飼料”開源性配方標準，首次建議飼料生產單位共同采用上述開源性配方參數配制飼料，以減少飼料間的質量差異，降低試驗偏差。由于天然飲食飼料原料營養成分存在變異性，為保證動物試驗結果來源于穩定的飼料營養背景，方便相關領域研究學者提供飼料配方模板，確保不同研究團隊在不同時間研究間的重復性，美國營養研究所（American Institute of Nutrition，AIN）于1977年建議將純化飼料AIN76配方作為“標準實驗動物日糧”［6］，并增加了維生素K和抗氧化劑特丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）在飼料配方中的比例。隨著各項研究的有效推進，1993年AIN76配方被完善為AIN93G繁殖階段配方和AIN93 M維持階段配方，并對蛋白質、脂肪和碳水化合物等營養成分作出了相應調整：蛋白質，酪蛋白中缺乏含硫氨基酸，配方中額外添加L-半胱氨酸替代DL-蛋氨酸，增加飼料中含硫氨基酸比例；脂肪，分析測試結果顯示玉米油不能為動物提供足夠的亞油酸，且不能提供適宜比例的多不飽和脂肪酸，因此用n-6/n-3比例更為合理的大豆油取代玉米油；碳水化合物，在加工過程中，玉米淀粉可以產生過多熱量，導致飼料容易破碎，影響飼料制粒效果，因此用玉米糊精粉替代部分淀粉，提高飼料硬度［7］。此外，美國科學院的全國理事會（National Research Council，NRC）也分別于1962年、1972年、1978年、1995年和2007年共五次修訂和完善了大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、沙鼠、田鼠在能量、蛋白質、氨基酸、脂肪、碳水化合物、維生素、礦物質等方面的營養需要。美國國家毒理計劃（National Toxicology Program，NTP）結合自身研究實際，并參考NIH、AIN-95與NRC標準，制定了NTP標準飼料配方。除美國外，其余國家也根據生產和養殖條件制定了具有地方特色的實驗動物營養需要標準，如英國農業研究委員會（Agricultural Research Council，ARC）標準，日本在參考ARC標準理想蛋白質模式基礎上，確定了動物氨基酸需要量，形成了該國的實驗動物飼養標準［8］。由于AIN標準充分發揮了純化日糧優勢，有益于科研人員在飼料制備過程中減少可變因素，更利于實驗人員獲得質量相對均一、穩定的動物飼料，與動物實驗單一變量原則契合，因此，以AIN93G和AIN93M為標準的實驗動物生長、繁殖和維持階段的純化日糧飼料配方以及相應的飼料加工工藝、輻照滅菌標準和存儲方式在實驗動物科研領域被廣泛認可和大量使用［9］。

將飼料作為營養供給載體，除提供實驗動物的正常生長、繁殖所需營養外，研究人員還利用養分的缺乏、過量以及比例間的失衡配制飼料，引起動物生理機能改變，以此獲得動物疾病模型，這樣的飼料被稱為疾病模型飼料［10］。自1984年，國外科研團隊開始進行實驗動物疾病模型飼料研究，其中Ulman博士成立的Research Diets，Inc.成功研制和推廣了超過20 000多個純化飼料配方誘導的動物疾病模型，如肥胖模型、糖尿病/胰島素抵抗模型、非酒精性脂肪肝模型、高血壓模型、代謝綜合征模型、免疫模型、動脈粥樣硬化模型、癌癥模型等，涉及大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、兔、豬及非人靈長類等大多數實驗動物，覆蓋了生命科學的大部分研究領域，并建立和公開了相應的飼料配方數據庫，其中接近700余種的純化飼料配方獲得已發表科研文獻引用，成為當前全球疾病模型飼料標準化的“標桿”［11］。

3 我國實驗動物飼料標準化工作現狀

相較于歐美發達國家，我國實驗動物飼料標準化起步較晚。1988年，國家科委發布第二號令，要求在生命科學等領域內采用標準化實驗動物，自此實驗動物飼料標準化正式提上日程［12］。1994年和2001年，中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局相繼發布和完善了實驗動物飼料營養國家標準（GB 14924—1994和GB 14924—2001），但由于上述國家標準不是根據動物不同時期營養需要而制定的營養標準，同時部分微量元素和維生素需要量在標準中也未作明確，降低了標準在執行過程中的可操作性。針對上述問題，2010年，全國實驗動物標準化技術委員會編制完成了新的實驗動物飼料營養標準（GB 14924.3—2010），該標準合并了6種常見實驗動物營養需要量，完善了實驗動物營養需要量，修訂了原標準中部分常規營養成分含量指標，限制了維生素和礦物質添加量上限，并將飼料中常規營養成分、賴氨酸、蛋氨酸+胱氨酸指標作為強制性要求。與此同時，2001年至2010年，國內相關領域的專家和學者也制定和完善了實驗動物飼料在生產加工（GBT 34240—2017）、包裝儲存運輸（GB 14924.1—2001）、輻照殺菌（NYT 1448—2007）、質量控制（常規養分測定GBT 14924.9—2001，氨基酸測定GBT 14924.10—2008、礦 物 質測 定GBT 14924.12—2001、維生素測定GBT 14924.11—2001、衛生要求GB 14924.2—2001）等方面的國家標準，逐步填補國內實驗動物飼料標準化領域的空白，使我國實驗動物飼料生產和研究領域具備了權威的參考依據。在實驗動物疾病模型飼料方面，目前我國使用的大部分模型飼料配方充分借鑒了國外學者研究成果，然而受限于制作成本和加工工藝的影響，普遍存在人為調整配方各成分含量和比例的現象，加上國內外實驗動物具有一定遺傳特性的差異，本土化疾病模型飼料的使用效果大大降低。目前，國內關于實驗動物模型飼料的研究主要集中在以“基礎料+油脂+糖+膽固醇+膽酸”為主要特征的疾病模型飼料配方，具有顯著的配合飼料配方特征［10］。

4 我國實驗動物飼料標準化工作的主要問題

在實驗動物科技工作者的同心協力下，國內實驗動物科技領域從配合飼料研制、輻照殺菌劑量篩選，到營養結構日趨完整、疾病模型飼料的研制推廣，實驗動物飼料標準化工作正在不斷完善［5］，然而，對標國際上先進國家的實驗動物飼料標準化工作，我國實驗動物飼料標準化工作主要還存在以下問題。

一是飼料配方標準不明確。在畜牧生產領域，出于成本考慮，技術人員或科研工作者常采用“線性規劃”方式，規劃符合最小和最大營養濃度的飼料配方參數，形成多個畜禽飼料配方，以應對飼料原料短缺或價格波動，保證產品供應穩定，降低生產成本［13］，雖然現行國家標準明確了實驗動物配合飼料營養標準，但未給出具有指引性的飼料配方參數，給飼料配方設計增加了很多變量，為生產單位留下較大的可變實施空間。豆粕和魚粉是常規的飼料蛋白來源，動物實驗結果證實，在相同蛋白含量的條件下，高含量的豆粕組出現動物腸道結構破壞，腸道褶皺短而稀疏，腸壁厚度不均勻等異?，F象［14］，說明按照“線性規劃”方式形成的飼料配方并不能實現實驗動物飼料標準化。實驗動物飼料在生產目標上與畜禽養殖有著本質的不同，實驗動物飼料是要求動物生理生化指標標準和穩定，而不是追求最佳的料肉比，因此“線性規劃”方式形成的飼料配方不宜在營養學、毒理學或其他類型的實驗動物領域應用［6］。

二是飼料營養標準不完善。能量是動物維持正常生命活動的必需營養物質，動物的營養供給均需要以能量作為基礎［15］，在NRC和國內畜禽營養需要標準中，均明確了動物能量需要量。研究證據表明，限制實驗動物的熱量攝入有益于延長動物壽命，降低退行性疾病的發生率和嚴重程度以及腫瘤的發病率［16］。因此，在長期的毒性試驗和衰老研究中更需要明確飼料中能量的需求，但遺憾的是，最新的實驗動物營養需求中，未對實驗動物能量需求進行統一規定。同時，現行的實驗動物飼料營養標準強調了“營養達標或缺乏”，即營養缺乏的日糧容易導致實驗動物生長發育受阻，導致動物生理指標異常［17］，脂肪含量偏高將影響實驗動物生理參數，長期飼喂高脂飲食將誘導動物成為“疾病模型”［18］，但標準未明確部分營養成分最高限量。此外，動物的營養需要受動物種類、生長階段和使用目的等因素影響［19］，由于缺乏基礎研究，現行國家標準未制定針對不同動物品系、生長階段和研究目的實驗動物飼料營養需要，采用較為“粗獷式”營養標準。

三是飼料原料標準不精細。高品質的飼料不僅需要優良的飼料配方，還需要來源穩定，營養結構相對保守的飼料原料提供支持［6］。在最新的GB 14924.3—2010國家標準中，雖然明確了常規的飼料原料質量標準，但其中重要的能量飼料玉米、蛋白質飼料豆粕和魚粉質量標準引用的均是已經廢止的國家或行業標準，并未及時更新。此外，部分推薦飼料原料含有抗營養因子，使用過量會對動物健康造成不利影響，如豆粕中含有的胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素、胃腸脹氣因子、大豆抗原等，花生餅（粕）中含有的胰蛋白酶抑制因子，高粱中含有的單寧等，不僅會降低飼料中營養物質的利用率，而且容易引起動物中毒，出現代謝異常［20］。然而，最新的實驗動物飼料標準未對含有抗營養因子飼料原料的使用范圍提出要求。

四是質控體系建設不健全。飼料品質控制是實現實驗動物飼料標準化的重要手段。目前，我國針對實驗動物飼料的常規營養如氨基酸、礦物質和維生素等制定了檢測標準，并要求生產單位需要每年至少一次在省級以上資質認定或國家實驗室認可資格的機構進行檢測，然而國內部分區域并未建立專門的實驗動物飼料質量檢測第三方平臺，只能在農牧業的飼料檢測平臺上，采用農業的飼料檢測標準進行飼料檢測，缺乏對實驗動物飼料的針對性。

5 我國實驗動物飼料標準化工作建議

實現實驗動物飼料標準化的核心工作就是生產出營養成分可控、營養結構保守的實驗動物飼料，因此需要從標準化體系建設、標準執行和質量監督等方面建立一套操作性強、適宜于推廣的統一標準。

一是加強標準化體系建設。原料供給與配方參數標準化是整個流程的核心，也是目前我國實驗動物飼料標準化工作的技術難點和薄弱環節。規范飼料配方參數和原料供給是首要任務。雖然AIN93系列純化日糧備受推崇，但是其飼料原料成本高昂，國內大型實驗動物中心難以承受，且對加工工藝要求高，國內僅少數生產單位能達到要求，難以在國內實驗動物行業進行大規模的推廣實施。此外，AIN93系列純化日糧本身在動物試驗中存在缺陷。研究表明，該純化日糧容易導致動物缺乏微量元素，引起動物抗應激能力、抗毒性損傷和抗癌能力下降，腸道中7-乙氧基試鹵靈O-脫乙基酶活性顯著降低［3］。在小鼠腸道上的研究也證實，AIN93系列的5%纖維素純化日糧會引起動物腸道菌群多樣性降低［21］。同時，以谷物為基礎的5%纖維含量的天然日糧增加了小鼠腸道短鏈脂肪酸含量，更益于恢復腸道的菌群多樣性［22］。因此，結合實驗動物飼料標準化要求，建立和推廣統一的適合我國國情的實驗動物飼料天然日糧標準配方顯得尤為必要。在制定配方的過程中，建議以GB 14924.3—2010標準為實施基礎，借鑒國內外飼料配方制定原則，選擇來源廣、成本低、營養成分穩定的飼料原料為動物提供能量（如玉米、膨化大豆粉、大豆油、魚油）、蛋白質（如魚粉和豆粕）、脂肪（如大豆油、魚油）和碳水化合物（如玉米、小麥），同時在加工損耗基礎上，計算維生素和微量元素剩余添加量，以預混料形式添加到飼料中，此外，在配方設計過程中應注重碳水化合物添加水平，調節飼料制粒質量、硬度和適口性，以此形成最終的推薦配方。針對既定配方，建議從產地、加工工藝、營養成分等角度，規范飼料原料質量標準，形成“標準原料-標準配方-標準生產工藝-標準飼料”飼料加工體系。另外，還要加強營養需要基礎研究。與畜禽營養需要研究不同的是，國內大量的實驗動物營養需要基礎研究嚴重滯后于歐美發達國家。以大鼠為例，截至1995年，國外學者便確定了能量（總能、消化能、代謝能、凈能）、蛋白質（15種必需氨基酸和非必需氨基酸）、脂肪（必需脂肪酸n-3和n-6）、碳水化合物和纖維（葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、糊精等）、礦物質（15種常量和微量礦物質）、維生素（4種脂溶性維生素和9種水溶性維生素）等在大鼠各生理階段（離乳斷奶、生長維持、繁殖泌乳）的營養需要（表1）［3］，并針對上述營養，著重研究了營養缺乏條件下動物的異常反應［3］。截至目前，國內關于大鼠營養方面的研究主要集中于蛋白質［23］、少數氨基酸［24］、礦物質［25］和維生素［26］，系統性較差，不能在營養需要標準制定上形成合力。由于實驗動物營養需要受遺傳、外界環境、實驗方式、動物遺傳背景和營養互作等綜合因素影響［3，27］，且國內實驗動物背景和日糧組成與國外差異較大，因此國內實驗動物營養需要不能簡單地借鑒國外研究成果，而是需要加大我國在實驗動物營養需要研究中的投入，利用國外實驗動物和國內畜禽在營養需要研究上取得的成果，重新整理和完善國內不同實驗動物在不同階段的精準營養需要，為實驗動物飼料標準化工作提供充足的理論支撐。同時，還要加快推進疾病模型飼料的標準化研究，一方面需要重新考察國外純化日糧配方具體使用效果，完善以此為基礎的飼料配方參數和加工制作標準流程，為國外純化飼料的進一步使用提供參考和依據。另一方面需要重新梳理和整理國內非純化日糧或半純化日糧在建立疾病模型上的作用，逐漸讓此類的“國產化”配方被國際同行所認可和接受。此外，隨著基因工程技術的發展，基因敲除（如載脂蛋白E基因敲除、脂蛋白脂酶基因敲除、血管活性腸肽基因敲除）和免疫缺陷小鼠已逐漸進入實驗動物領域，而上述動物由于部分基因的改變將會影響動物正常的營養代謝，因此，常規的飼料營養標準和飼料配方思路與基因敲除和免疫缺陷小鼠的具體需要存在一定差異。載脂蛋白E基因敲除小鼠因基因缺失（沉默），導致動物體內脂蛋白代謝和轉運發生改變，體內膽固醇清除率降低［28］，是動脈粥樣硬化研究的良好自發模型。但載脂蛋白E基因敲除小鼠在正常飼喂時發病周期較長，不利于疾病模型構建，因此需要針對性配制特殊代謝特征的配合飼料，縮短造模周期，強化發病癥狀。腫瘤及免疫學研究需要大量的免疫缺陷小鼠，由于免疫缺陷小鼠的特殊生理特性，存在繁殖力低下、種鼠換代快及幼鼠體質弱等問題，目前主要通過鋅、硒、益智莖葉或者螺旋藻的添加改善免疫缺陷鼠的繁殖性能［29-31］，但尚未形成統一的飼料配方標準。因此，應加大對這些特殊模型動物營養需求的研究力度，制定針對性的標準化飼料配方。

表1 大鼠維持、生長和繁殖階段營養需要量Table 1 Nutrient requirements for maintenance,growth,and reproduction of rats

二是建立健全實驗動物飼料質控體系。在飼料質量管理方面，雖然可以借鑒畜牧行業的既有經驗，但是兩者實施目標不同、衛生指標要求不同，服務對象和管理要求也不同，這意味著兩者的質控體系建設存在一定差異。目前，實驗動物飼料已形成較為完善的從原料控制、加工能力、加工工藝、原料與成品抽檢、包裝、輻照以及運輸上的質量控制標準和規范，但由于經濟體量小，所處環節易受忽視，生產單位在執行上述規范時缺乏行業監管。因此，行業主管部門應重視實驗動物質量監管，嚴把飼料生產單位準入標準關，引導建立針對實驗動物飼料個性化和差異化的檢測平臺或通道，制定標準化的檢測流程，促進常態化監管與程序化監管的結合，做好市場隨機抽樣和生產地址定點抽樣送檢，加強實驗動物飼料原料和成品檢測技術方面理論的研究和探索，從專業技術層面為實驗動物飼料檢測工作提供支撐。

6 小結

綜上所述，實驗動物飼料標準化對實驗動物相關科研工作意義深遠。目前我國實驗動物飼料標準化工作進程滯后于歐美發達國家，現有的實驗動物飼料標準化工作雖然填補了國內相應領域空白，但在飼料標準化體系建設和質控監督等關鍵環節還有很大的提升空間，因此需要在配方參數與原料標準、理論基礎研究和質控體系中補足短板，確保標準的實驗動物飼料品質，為我國實驗動物標準化提供支持。

[作者貢獻Author Contribution]

羅建波完成涉及實驗動物內容部分的撰寫；付敏完成涉及畜禽動物內容部分的撰寫；李軍暉負責意見咨詢；周佳和何勇負責修改建議。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。