基于生物信息學分析TCEB1在肝癌中的表達及意義

陳 平,李林海,吳 為

(重慶大學附屬三峽醫院,中國重慶 404100)

肝癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一,也是全球癌癥相關死亡的第4大病因,其中肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的病理類型[1]。由于高復發率和轉移率,進展期肝癌患者的5年生存率仍較低。另一方面,肝癌細胞耐藥的發展,使得現有靶向藥物的治療效果并不理想。因此,深入探索肝癌發生發展的分子機制,尋找與預后有關的生物標志物及潛在治療靶點至關重要。轉錄延伸因子B1(transcription elongation factor B subunit 1,TCEB1),又名延伸蛋白C(elongin C,ELOC),和延伸蛋白A/A2、延伸蛋白B一起組成轉錄因子B(SⅢ)復合體,通過與RNA多聚酶Ⅱ的直接相互作用,激活轉錄延長[2]。研究表明,TCEB1基因的突變和拷貝數擴增分別與腎癌和前列腺癌的發生發展密切相關[3～5],但TCEB1基因在肝癌中的表達、改變情況及臨床意義尚不清楚。本研究利用生物信息分析工具對肝細胞癌患者腫瘤樣本、癌旁正常組織或健康對照樣本進行數據挖掘分析,探索TCEB1基因在肝癌中的表達、改變情況、預后價值及其潛在的功能。

1 材料與方法

1.1 GEPIA2分析

GEPIA2(Gene Expression Profiling Interactive Analysis 2;http://gepia2.cancer-pku.cn;2021-07-05)[6]是一個可分析9 736個腫瘤和8 587個健康樣本RNA序列數據的網站服務器,其樣本來自于癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因型組織表達數據集(The Genotype-tissue Expression,GTEx)。本研究利用該平臺分析TCEB1在肝癌組織和正常組織中的表達差異,以及TCEB1 mRNA水平和肝癌患者預后的關系。參數設置全部選擇默認。

1.2 UALCAN分析

UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu/;2021-07-05)[7]可在線分析TCGA數據,比較腫瘤分級、分期、患者年齡、種族、腫瘤分子亞型等不同臨床病理特征與基因表達的相關性。本研究利用該平臺分析TCEB1基因表達與肝癌患者臨床病理特征的相關性。參數設置全部選擇默認。

1.3 cBioPortal分析

cBioPortal(http://www.cbioportal.org;2022-09-28)[8]包含多個數據庫,如TCGA和國際癌癥基因組聯盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)等,共涉及283項大型腫瘤相關的基因組和蛋白質組學研究,并提供分析癌癥相關基因數據的可視化工具。本研究利用cBioPortal分析肝癌組織中TCEB1基因的改變情況(如基因突變、擴增等)及其與患者預后的關系。參數設置全部選擇默認。

1.4 TCEB1相關基因及其富集分析

LinkedOmics(http://www.linkedomics.org/login.php;2021-07-05)[9]是一個基于網絡的分析平臺,可分析來自TCGA的32種原發性腫瘤的多組學數據。LinkFinder是LinkedOmics的一個分析模塊,在本研究中用于探究TCEB1的相關基因,結果以火山圖、熱圖呈現。條件設置如下:1)“Cancer cohort:TCGA_LIHC”;2)“Search dataset:TCGA LIHC RNAseq”;3)“Gene:TCEB1”;4)“Target dataset:TCGA LIHC RNAseq”;5)“Statistical method:Pearson correlation test”,以偽發現率(false discovery rate,FDR)＜0.01為相關基因的篩選標準[10]。篩選P＜0.05且相關系數絕對值大于0.5[11]的相關基因輸入Metascape(http://metascape.org),種屬選擇H.sapiens,隨后進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能注釋、京都基因和基因組數據庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析,并利用在線工具微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)對分析結果作圖。

1.5 蛋白質互作網絡構建

GeneMANIA(http://genemania.org/;2021-07-05)[12]可在線構建蛋白質-蛋白質相互作用(proteinprotein interaction,PPI)網絡。該網站使用生物信息學方法可顯示一系列相互作用的蛋白質,同時可顯示蛋白質物理相互作用、共表達、共定位、基因富集分析和網站預測等。本研究利用Gene-MANIA構建TCEB1的PPI網絡。參數設置全部選擇默認。

1.6 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0進行統計分析。TCEB1基因不同拷貝數的組間比較,若符合正態分布,采用單因素方差分析(one-way ANOVA),若不符合正態分布,采用非參數檢驗。其余所有統計結果均為數據庫自動計算生成。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCEB1在肝癌和正常肝臟組織差異表達

通過GEPIA在線分析TCGA和GTEx數據集中肝癌組織和正常肝組織TCEB1 mRNA的相對表達量,我們發現,與正常肝組織比較,肝癌組織中TCEB1 mRNA的表達量顯著增加(P＜0.05)(圖1)。

圖1 TCEB1在肝癌組織和正常肝組織中的表達Fig.1 Expression of TCEB1 in HCC and normal liver tissues

進一步利用UALCAN分析TCGA數據,以了解不同臨床病理特征肝癌組織中TCEB1的表達。結果顯示:肝癌組織中TCEB1 mRNA水平越高,患者腫瘤分級越差(P＜0.05)(圖2A),但肝癌組織中TCEB1 mRNA水平在各腫瘤分期中無顯著差異(圖2B);TCEB1在男性患者肝癌組織中的mRNA表達量明顯高于女性患者(P＜0.05)(圖2C);TP53突變的肝癌組織中TCEB1 mRNA水平較無突變的肝癌組織明顯升高(P＜0.05)(圖2D)。

圖2 TCEB1 mRNA表達水平與肝癌患者不同臨床病理參數和基因表型的關系(*P＜0.05)(A)TCEB1在肝癌不同分級中的表達;(B)TCEB1在肝癌不同分期中的表達;(C)TCEB1在不同性別肝癌患者中的表達;(D)TCEB1在不同TP53基因表型中的表達。Fig.2 Relationships between the expression level of TCEB1 mRNA and different clinicopathological features and between the expression level of TCEB1 mRNA and gene phenotypes in HCC patients(*P＜0.05)(A)The expression level of TCEB1 in different grades of HCC;(B)The expression level of TCEB1 in different tumor stages of HCC;(C)The expression level of TCEB1 in male and female patients with HCC;(D)The expression level of TCEB1 in HCC with or without TP53 mutation.

2.2 TCEB1的表達水平與肝癌患者預后的關系

利用GEPIA在線分析TCGA數據集中364例肝癌組織TCEB1基因的表達水平與患者預后的關系。以TCEB1基因表達的中位數為標準,將患者分為TCEB1基因高表達組(n=182)和低表達組(n=182)。結果表明,TCEB1基因高表達組患者的總體生存時間顯著低于低表達組(P=0.025)(圖3A),但兩組患者的無病生存時間無明顯差異(P=0.16)(圖 3B)。

圖3 TCEB1基因表達與肝癌患者生存預后的關系(A)TCEB1基因表達與肝癌患者生存時間的關系;(B)TCEB1基因表達與肝癌患者無病生存時間的關系。Fig.3 Relationship between TCEB1 expression and the prognosis of HCC patients(A)Relationship between TCEB1 expression and the overall survival of HCC patients;(B)Relationship between TCEB1 expression and the disease free survival of HCC patients.

2.3 肝癌中TCEB1基因改變情況

為了解TCEB1在肝癌組織中是否存在基因突變或拷貝數擴增等基因改變,我們檢索了cBio-Portal數據庫,發現在7個研究共1 136例肝癌患者中有52例患者(5%)的TCEB1發生了基因改變(基因突變、拷貝數擴增或結構變異)(圖4A)。TCEB1基因拷貝數擴增與其mRNA表達呈正相關(圖4B)。數據分析中共有3個研究(MERiC,Basel 2021;AMC,Hepatology 2014;TCGA,Firehose Legacy)提供了患者的生存數據,其中,MERiC對患者生存數據的描述為患者生存狀態,另外兩項研究對患者生存數據的描述為患者總體生存狀態。因此,我們只納入了后兩項研究進行生存分析,結果顯示,發生TCEB1基因改變的肝癌患者的總生存時間顯著低于無基因改變的患者(P=0.012 9)(圖4C),但兩組患者的無病生存時間無顯著差異(P=0.379)(圖4D),表明TCEB1基因改變可能提示預后不良。

圖4 肝癌組織中TCEB1基因改變情況及其與患者預后的關系(A)TCEB1基因改變視覺圖;(B)TCEB1基因拷貝數變異與其mRNA表達的關系;(C)肝癌患者有/無TCEB1基因改變的總生存曲線;(D)肝癌患者有/無TCEB1基因改變的無病生存曲線。Fig.4 The gene alteration of TCEB1 in HCC tissues and its relationship with prognosis of patients(A)OncoPrint plot of TCEB1 alterations;(B)Relationship between TCEB1 expression and copy number variations(CNVs)in HCC;(C)The overall survival curve of HCC patients with/without TCEB1 alteration;(D)The disease free survival curve of HCC patients with/without TCEB1 alteration.

2.4 TCEB1相關基因及其富集分析結果

為探索TCEB1在肝癌發生發展中可能的生物學功能,我們利用LinkedOmics數據庫分析TCGA_LIHC數據集中TCEB1的相關基因。結果表明,以FDR＜0.01為篩選標準,共有9 554個相關基因,其中4 152個基因與TCEB1顯著正相關,5 402個基因與TCEB1顯著負相關(圖5A)。圖5B和5C分別顯示與TCEB1呈顯著正相關和負相關的前50個基因。

圖5 TCEB1相關基因(A)TCEB1相關基因火山圖;(B)TCEB1正相關基因熱圖(前50個基因);(C)TCEB1負相關基因熱圖(前50個基因)。Fig.5 TCEB1 correlated genes in HCC(A)Volcanic map showing the global highly correlated genes with TCEB1;(B)Heat map showing the top 50 genes positively correlated with TCEB1;(C)Heat map showing the top 50 genes negatively correlated with TCEB1.

我們進一步將P＜0.05且相關系數絕對值大于0.5的相關基因通過Metascape進行GO注釋和KEGG通路分析。GO注釋結果表明,TCEB1及其相關基因在生物過程(biological process,BP)中主要富集在核糖核蛋白復合體生物合成、基因翻譯、線粒體的組織等(圖6A),在細胞組分(cellular component,CC)中主要富集在核糖體亞單位、包含線粒體蛋白的復合體、轉移酶復合體等部位(圖6B),在分子功能(molecular function,MF)中主要與轉錄因子結合、泛素樣蛋白轉移酶活性、鈣黏著蛋白的結合等有關(圖6C)。KEGG通路富集分析結果顯示,TCEB1相關基因主要富集在核糖體、腎細胞癌、泛素介導的蛋白質水解等信號通路(圖6D)。

圖6 TCEB1相關基因的前10條GO注釋和KEGG通路分析(A)生物過程;(B)細胞組分;(C)分子功能;(D)KEGG分析。Fig.6 The top 10 significantly enriched GO annotations and KEGG pathways of TCEB1 related genes(A)The biological process;(B)Cellular component;(C)Molecular function;(D)KEGG analysis.

2.5 TCEB1蛋白相互作用網絡

GeneMANIA分析共篩選出20個已證實或預測的與TCEB1相互作用的蛋白質,包括TCEB2、VHL、CUL2、PPRC1、SOCS1、CUL5、RAB40B、PRKAG2、CTD-2410N18.5、SKP1、RBX1、SLC25A39、CBFB、SOCS3、C6orf141、NEK9、STK16、NELFE、TCEB3、POLR2K,相互作用關系包括物理相互作用、共表達、共定位、共享蛋白質結構域、遺傳互作(圖7)。

圖7 TCEB1的蛋白質相互作用網絡Fig.7 The protein-protein interaction network of TCEB1

3 討論

TCEB1是轉錄激活因子延伸蛋白復合體(SⅢ)、VHL(von Hippel-Lindau)蛋白復合體和E3泛素連接酶的組成成分[13～15],在細胞中有許多功能。研究表明,含有TCEB1的泛素連接酶可作用于許多轉錄因子,如低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)[16]、p53[17]、c-Myc[18]和核因子 κB(nuclear factor-κB,NF-κB)[19]。TCEB1 不僅可作為底物受體與泛素連接酶的底物直接相互作用[20],還可介導cullin蛋白與底物受體間的連接[21]。TCEB1位于8q21.11染色體區,近年來8號染色體長臂(8q)的擴增被認為與前列腺癌的浸潤性進展和不良預后有關[22]。Porkka等[23]通過熒光原位雜交分析表明,23%的激素非依賴型前列腺癌有TCEB1基因擴增,且TCEB1基因擴增與進展期雄激素非依賴型前列腺癌有關,而激素依賴型前列腺癌沒有TCEB1基因擴增。Agell等[22]的研究表明,在進展期前列腺癌中,TCEB1的基因和蛋白質表達明顯增加。Jalava等[3]的研究表明,TCEB1可能通過增加侵襲相關基因的表達促進前列腺腫瘤細胞的侵襲。Hakimi等[24]通過對TCEB1基因突變的腎細胞癌進行遺傳和病理特征分析發現,發生TCEB1基因突變的腎細胞癌是一種不同于透明細胞腎癌和透明細胞乳頭狀腎癌的特殊類型腎癌。

既往關于TCEB1在腫瘤中的研究主要集中在泌尿系統,尚無在肝癌中的報道。本研究通過對TCGA等數據庫的數據挖掘和分析發現,TCEB1在肝癌組織中的表達顯著高于正常肝組織(圖1),且TCEB1 mRNA在男性患者、腫瘤分級高、合并TP53突變的肝癌組織中水平更高(圖2),提示TCEB1可能作為促癌基因參與了肝癌的發生發展。TCEB1基因在肝癌中的表達與性激素、TP53突變的相關性及具體的分子機制值得進一步研究。生存分析結果表明,TCEB1 mRNA水平與患者生存時間呈負相關(圖3),提示TCEB1可作為肝癌患者預后不良的預測因子。

通過cBioPortal在線分析7個研究共1 136例肝癌患者的肝癌樣本,我們發現有52例(5%)樣本存在TCEB1基因改變(圖4A),且基因拷貝數擴增與TCEB1 mRNA水平呈正相關(圖4B),提示TCEB1在肝癌組織中的表達量增加可能部分與基因拷貝數擴增有關。生存分析表明,與未發生TCEB1基因改變的肝癌患者比較,發生TCEB1基因改變的患者總生存時間顯著縮短,提示預后不良(圖4C)。但各研究中患者生存數據的定義可能不同,因此,TCEB1的基因改變與患者預后的確切關系有待進一步大樣本研究證實。

為進一步探索TCEB1在肝癌中可能的生物學功能,我們對TCEB1相關基因進行了功能注釋和通路富集分析,結果提示,TCEB1相關基因的分子功能主要富集于轉錄因子結合、RNA的催化活性、泛素樣蛋白轉移酶活性、鈣黏著蛋白結合等(圖6C),部分與已知TCEB1的功能相一致。鈣黏著蛋白是一組跨膜糖蛋白,主要參與同源細胞間的連接。目前,至少有9種鈣黏著蛋白亞家族與腫瘤有關,其中E-鈣黏著蛋白的功能缺失被認為是上皮間質轉化過程中的重要事件,而后者是腫瘤侵襲、轉移的重要信號,因此,E-鈣黏著蛋白被認為是腫瘤生長侵襲的重要抑制因子[25]。本研究提示,TCEB1相關基因的分子功能與鈣黏著蛋白結合有關,說明TCEB1可能通過影響鈣黏著蛋白的分子功能促進肝癌細胞的侵襲轉移,但這一假設需進一步的實驗研究證實。

通過GeneMANIA構建的TCEB1蛋白相互作用網絡顯示,TCEB2、VHL、CUL2(Cullin2)等在蛋白質網絡中發揮重要作用(圖7)。VHL是腫瘤抑制蛋白,研究表明在體外它可與延伸蛋白A競爭性結合延伸蛋白B和C,從而抑制延伸蛋白活性[26]。此外,VHL蛋白可與轉錄延伸蛋白B和C(TCEB2和 TCEB1)、CUL2、Rbx1形成 VCB-CR 復合體,參與低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)的蛋白質降解[16,27～28]。另有研究表明,TCEB1突變可破壞TCEB1與VHL的結合,導致VHL介導的蛋白質水解功能缺失,這是透明細胞腎細胞癌的共同特征[29]。TCEB1突變在肝癌發生發展中的作用和具體機制有待進一步研究。

綜上所述,本研究通過對TCGA等公共數據庫的分析發現,TCEB1在肝癌組織中顯著高表達,且為肝癌患者的不良預后因素,提示其可能參與了肝癌的發生發展;通過對TCEB1相關基因進行GO和KEGG分析以及構建TCEB1蛋白互作網絡,初步探討了TCBE1在肝癌發生發展中可能的生物學功能。本研究為肝癌患者的預后評估提供了新思路,為其治療提供了新的潛在分子靶點。