木質素與纖維素酶間相互作用及其抑制纖維素酶水解的研究進展

李大林黃六蓮，2陳禮輝，2羅小林，2，3劉 婧，2，

（1.福建農林大學材料工程學院，福建福州，350002；2.植物纖維功能材料國家林業和草原局重點實驗室，福建福州，350002；3.南京林業大學江蘇省制漿造紙科學與技術重點實驗室，江蘇南京，210037）

盡管化石燃料（如汽油和柴油等）促進了人類社會的快速發展，但其也在全球范圍內引發一系列環境問題［1-2］?；诳稍偕?、廉價及來源豐富等特性，木質生物質已成為制備燃料化學品的理想原材料［3-6］。酶水解和發酵可將木質生物質轉化為燃料化學品（如乙醇或丁醇）。但在酶水解前，通常需采用物理或化學預處理來突破木質生物質致密結構對酶的抗降解屏障［7］。盡管現有預處理方法（如熱水、稀酸、稀堿、氨纖維爆破、亞硫酸鹽、離子液體或低溫共溶劑等）可在一定程度上破壞木質生物質的致密結構，提高預處理固體基質中纖維素對酶的可及性，但預處理（特別是酸法預處理）也會促使細胞壁內木質素發生解聚、移位、縮合和反沉積。研究發現，沉積木質素可對纖維素酶組分產生嚴重的無效吸附［8］。這種無效吸附不僅使酶水解液中有效作用于纖維素的酶分子減少，而且也會影響部分酶組分的活力，導致預處理固體基質中酶水解效率下降。為獲得較高的纖維素酶水解轉化率，纖維素酶用量則隨之增加。因商品纖維素酶價格昂貴，這導致酶水解過程中的酶成本達到纖維素燃料乙醇整體生產成本的30%~50%?？梢?，木質素對纖維素酶的無效吸附已成為嚴重制約纖維素基燃料化學品產業（如燃料乙醇等）發展的技術瓶頸［7-10］。

除對酶分子進行改造和對木質素分子進行化學修飾外，研究者主要通過向酶水解液中添加屏蔽劑（如牛血清蛋白［11］、聚乙烯醇［12］或Mg2+等［13］）來克服木質素對纖維素酶的不利影響。然而，因木質素和纖維素酶間作用機制較為復雜，現已開發的木質素屏蔽劑存在成本較高（如牛血清蛋白）［10，14］或影響后續發酵微生物活性及發酵液后處理效率等缺陷［15］?？梢?，確定木質素與纖維素酶間相互作用機制是合理開發新型木質素屏蔽劑、減少木質素對酶無效吸附以及降低燃料乙醇生產成本的重要理論基礎。因此，除簡要介紹木質素及纖維素酶物化特性外，本文重點概述木質素與纖維素酶間相互作用、兩者相互作用的表征以及木質素屏蔽劑緩解木質素對纖維素酶不利影響的研究進展。

1 木質素和纖維素酶的物化特性

盡管預處理方法及其劇烈程度均對殘余木質素結構和官能團產生不同影響（見表1），但預處理過程中木質素主要發生解聚（如β-O-4和α-O-4芳基醚鍵斷裂等）和縮合（如β-β′、5-O-4′、5-5′等連接結構的形成）兩類反應。因此，基于前期研究［16-33］，預處理后殘余木質素分子中可與纖維素酶發生作用的官能團主要包括：①非離子化基團，如酚羥基、脂肪羥基和苯基等；②離子化基團，如—COOH和—SO3H等。

表1 不同預處理殘余木質素的物理化學特性Table 1 Physicochemical properties of residual lignin from different pretreatments

為提高協同催化效率，商品纖維素酶通常含有多種組分，主要包括外切葡聚糖酶（CBH）Ⅰ~Ⅱ型、內切葡聚糖酶（EG）Ⅰ~Ⅴ型、β-葡萄糖苷酶（β-G）Ⅰ型等（見表2）［8，23］。由表2可知，除相對分子質量外，不同酶組分的等電點（pI）也不同，即在特定pH值（如pH值為5的醋酸-醋酸鈉）的緩沖液中，不同酶組分表面電荷特性不同（如CBHⅠ、EGⅠ和EGⅤ帶正電，其他組分帶負電）。同時，不同酶組分的疏水性也不同，里氏木霉（T.reesei）和黑曲霉（A.niger）代謝產生的纖維素酶組分按照疏水性由高到低的次序為：EGⅣ>EGⅤ>CBHⅡ>β-GⅠ>EGⅡ>EGⅢ>EGⅠ>CBHⅠ。

表2 纖維素酶組分的物理化學特性Table 2 Physicochemical properties of cellulase components

基于木質素和纖維素酶組分的物理化學特性，大量研究表明，木質生物質預處理后殘余木質素可對纖維素酶產生顯著的無效吸附。無效吸附造成的不利影響主要包括兩方面：①木質素對纖維素酶產生無效吸附后，部分纖維素酶無法脫附，致使酶水解液中有效酶濃度顯著降低；②被吸附的部分纖維素酶分子結構發生重構，即便發生脫附，酶分子也會失去其催化活性。因此，除孔隙結構、半纖維素含量及纖維素本身特性外，固體基質內外表面殘余木質素對纖維素酶的無效吸附已被證實為影響纖維素酶水解效率的最重要因素之一［6，8，21-22］。

2 木質素與纖維素酶間的相互作用

為減少殘余木質素的無效吸附對酶水解過程的不利影響，大量研究從不同角度揭示木質素與纖維素酶間的相互作用機制?；谇捌趫蟮?，木質素與纖維素酶間的相互作用可總結為：①靜電作用，即纖維素酶帶電官能團和木質素帶電官能團間可發生靜電吸引或排斥作用；②疏水作用，即纖維素酶外層氨基酸殘基上烷基碳鏈與木質素上苯基或聯苯基團間發生疏水作用；③氫鍵作用，即纖維素酶外層氨基酸殘基上極性非電離基團（—OH、—COOH和—C（＝O）—NH2等）與木質素的羥基和羧基發生氫鍵作用；④離子-π作用，即纖維素酶組分中氨基酸殘基基團（如—NH3+）與木質素芳基基團（苯基和聯苯基等）產生的離子-π作用（見圖1）。因此，下述將從這4個方面來闡述木質素與纖維素酶間相互作用的研究進展。

2.1 靜電作用

根據前述研究［16，23-24，26-28］，木質素與纖維素酶間的靜電作用可產生2種效應：①靜電吸引引發纖維素酶組分的無效吸附或失活，降低酶水解效率；②靜電排斥減少木質素對纖維素酶的無效吸附，提高酶水解效率。

前期研究［15］發現，在pH值為5的酶水解緩沖體系中，帶正電的纖維素酶組分（如β-GⅠ（pI≈8）、EGⅢ（pI=6.8~7.4）和CBHⅡ（pI=5.2~5.9）可與帶負電的木質素產生無效吸附。Fritz等［25］發現，相同酶水解條件下，因楓木硫酸鹽未漂漿中木質素表面靜電荷高于楓木磨木木質素，前者對纖維素酶的吸附量比后者高20%。Kellock等［24］也報道了類似的現象。然而，將酶水解緩沖液pH值從常規的4.8~5.0調至5.2~6.2后，Lan等［26］發現，SPORL預處理固體基質（楊木和松木等）中纖維素的酶水解轉化率提高約20%。這主要是由于，提高緩沖液的pH值后，纖維素復合酶和SPORL預處理固體基質中木質素的Zeta電位均為負值，兩者間靜電排斥作用隨緩沖液pH值的升高而不斷增強，無效吸附相應減弱。同時，相關研究團隊［27-30］也相繼提出，增加木質素所帶負電荷有利于降低其對纖維素酶的無效吸附，進而提高固體基質中纖維素的酶水解效率。

總體而言，靜電排斥對預處理固體基質中纖維素酶水解效率的促進作用較為有限（<30%）［26-27］。由此可推測，在特定pH值的酶水解緩沖體系中，木質素非帶電基團（如苯基和酚羥基等）與纖維素酶特征基團間可能還存在其他類型的相互作用（見圖1）。

圖1 木質素與纖維素酶間存在的離子和非離子-π作用Fig.1 Ionic-and non-ionic-π interactions between lignin and cellulase

2.2 疏水作用

部分研究［32-35］認為，木質素芳基基團（如苯基和聯苯基團等）與纖維素酶外層氨基酸殘基上烷基基團（如亮氨酸烷基基團等）間的疏水作用是導致木質素無效吸附的最主要因素。例如，Lai等［32］發現，因針葉木木質素的疏水性高于闊葉木木質素，前者對纖維素酶的吸附力高于后者?；诜蛛x5種木質生物質（棉花、黑柳、白楊、桉樹和火炬松）中木質素的研究，Huang等［33］發現，木質素的疏水性越高，其對纖維素酶水解效率的抑制作用也越強。Qin等［36］對原子力顯微鏡（AFM）探針分別進行聚苯乙烯（PS）微球、羥基化或羧基化修飾，使探針具有相應的疏水或親水性質；結果發現，PS微球修飾探針對纖維素酶的吸附力比其他2種修飾探針分別高13%和43%，進而推測木質素芳基基團與纖維素酶分子烷基基團間的疏水作用是2種大分子間最主要的作用力。然而，除烷基基團外，纖維素酶外層氨基酸殘基上也可能含有芳香基團（如苯丙氨酸的苯基以及部分氨基酸殘基上的吲哚基團等），其也可能與木質素芳基基團產生π-π堆積作用［37］，該作用力對疏水作用的貢獻有待驗證。

與上述研究結果不同的是，Kellock等［24］發現，木質素對EGⅠ的吸附量顯著高于CBHⅡ，但EGⅠ的疏水指數（-0.37）明顯低于CBH II（-0.12）（見表2）。這可能是由于，盡管CBH II的疏水性高于EG I，但EG I氨基酸殘基上的苯丙氨酸（Phe）的數量高于前者?；贜eel等［38］對π-π堆積效應的系統論述，Gusakov等［23］證明，芳香性物質間的π-π堆積效應可強化其疏水作用?；诶碚撚嬎愫蛯嶒烌炞C，Sinnokrot等［39］和Krenske等［40］也分別發現，芳香性化合物（苯-苯和苯-咪唑等）分子間存在π-π堆積效應，其可能對疏水作用產生較大貢獻。對于纖維素酶而言，Yama‐guchi等［41］發現，通過基因編輯等手段將酶分子多肽鏈中部分Phe（含殘余苯基）替換為異亮氨酸（Ile，含殘余異丁基）后，其催化活性不變，但對木質素的吸附量顯著降低。由此，該研究團隊推測，基因編輯可降低多肽鏈中Phe苯基與木質素苯基間的π-π堆積效應，進而弱化兩者間的疏水作用。因此，π-π堆積對增強木質素與纖維素酶間疏水作用的機制仍有待深入探索。

2.3 氫鍵作用

根據現有研究，木質素與纖維素酶間的氫鍵作用主要體現在前者的羥基（酚羥基和脂肪羥基）與后者的羥基和酰胺基間的相互作用。然而，木質素酚羥基和脂肪羥基對此種氫鍵作用的影響程度不同。

相關研究［16，20］先后證實，隨著酸法預處理（LHW和DA等）劇烈程度的提高，盡管固體基質中半纖維素去除率顯著提高，其孔隙率也相應提高，但木質素降解后縮合程度也不斷提高，即便在高纖維素酶用量條件下，固體基質中纖維素的酶水解效率也難以再提高［42-44］。Sewalt等［45］推測，這主要是由木質素中酚羥基含量增加所致，其可能通過氫鍵作用加劇對纖維素酶組分的無效吸附。Yu等［21］和Sun等［22］將木質素上酚羥基含量和脂肪羥基含量與纖維素酶的吸附量以及酶水解效率進行定量關聯；結果發現，纖維素酶無效吸附量隨木質素酚羥基含量的提高而不斷增加，酶水解效率則隨之不斷下降。由此，這些研究者推測，木質素酚羥基與纖維素復合酶間的氫鍵作用力高于脂肪羥基與纖維素復合酶間的此種作用力。為驗證此結論，Yang等［31］對木質素酚羥基進行羥丙基化修飾，結果發現，木質素對純纖維素酶水解效率的抑制作用大幅降低（由70%降至15%），進而推測由酚羥基介導的氫鍵作用是木質素與纖維素酶間最主要的作用力。

2.4 離子-π作用

Dougherty［46］基于理論計算首次發現，陽離子（如Li+和K+等）與芳香性化合物（如苯和苯丙氨酸等）間存在陽離子-π作用。隨后Lu等［47］證實，基于納米力學分析，在液相環境（pH值3.0的乙酸溶液）中，帶正電的聚賴氨酸（P-Lys，殘余—NH3+）與芳香性聚色氨酸（P-Trp，殘余吲哚基）間存在陽離子-π作用。

根據Ko等［16］和Kellock等［24］的研究，在pH值為5.0的緩沖體系中，CBH I和EG I等纖維素酶組分均含有帶正電的氨基酸殘基基團（如—NH3+）。理論上，這些帶正電基團可與木質素芳基基團（苯基和聯苯基等）產生陽離子-π作用。早期，研究者推測，陽離子-π作用有利于促進木質素與陽離子聚合物（聚二烯丙基二甲基氯化銨）的自組裝［48］。近期，通過不同Debye長度外源離子（如Na+和K+等）排除靜電、氫鍵和疏水作用的干擾，在液相環境（酶水解緩沖液）中，本課題組［49］系統研究了木質素與纖維素酶間的納米力學行為，初步證明纖維素酶（Celluclast 1.5L?，T.reesei）與毛竹磨木木質素間存在陽離子-π作用力（見圖2）。

圖2 木質素與纖維素酶間的陽離子-π作用Fig.2 Cation-π interaction between lignin and cellulase

與陽離子-π作用類似，Gamez等［50］和Frontera等［51］先后證實，陰離子（如Cl-等）與芳香性化合物（如苯和咪唑等）間存在陰離子-π作用。在pH值為5.0的緩沖體系中，因EG III和β-G I等纖維素酶組分均含有帶負電的氨基酸殘基基團（如—COO-），理論上，其也可與木質素芳基基團產生陰離子-π作用。但目前，還未見木質素與纖維素酶間陰離子-π作用的相關報道。

3 木質素與纖維素酶間相互作用的表征

基于物理吸附及酶水解效率等宏觀研究手段，前期研究間接推測出木質素與纖維素酶間主要存在靜電、疏水和氫鍵作用［6，8，52］。盡管這些基礎研究為部分實際應用（如磺化木質素提高靜電排斥［24-25］、Mg2+弱化酚羥基介導的氫鍵作用[13]以及非離子型表面活性劑屏蔽疏水作用［34-35］等）奠定了理論基礎，但因2種大分子自身的復雜結構及宏觀實驗研究的局限性，部分研究結果間存在矛盾。Eriksson等［12］、Cai等［35］和Qin［36］等認為疏水作用是導致纖維素酶被無效吸附的主導因素；然而，其他研究者（Yu等［21］、Sun等［22］、Yang等［31］）則認為由酚羥基介導的氫鍵作用是最重要的影響因素。這主要是由于，纖維素酶含有多種組分，木質素結構和官能團較為多樣化，二者的相互作用也由此變得較為復雜。物理吸附和間接驗證（如木質素抑制酶水解效率）等宏觀手段往往無法獲得確定的研究結論。因此，引入更為微觀的研究手段則顯得尤為必要。

納米力學是指特征尺度在0.1~100 nm距離范圍內納米物體或納米界面間的力學行為［38，46-47］。在特定環境（如氣相或液相）中，基于微觀力學分析儀器（如AFM［36］和表面力儀（SFA）［47，49］），納米力學分析距離及力學強度的靈敏度可分別達到埃米和nN數量級，顯著提高了研究結果的準確性。據此，研究者近期利用SFA初步證實，木質素與纖維素酶間存在陽離子-π作用［49］?？梢?，區別于物理吸附和間接驗證等宏觀研究手段，納米力學分析可為揭示大分子間新型作用機制提供直接且可靠的實驗證據，有利于系統分析木質素與纖維素酶組分間的非共價作用機制。

4 木質素屏蔽劑對木質生物質酶水解的促進作用

盡管分子修飾或代謝基因改造等生物化學技術是降低木質素對纖維素酶產生不利吸附的理想手段，但木質素和纖維素酶分子結構及組成成分均較為復雜，基于木質素-纖維素酶相互作用來確定靶向改性位點的研究仍存在挑戰［52-53］。因操作簡單、成本低、效果明顯等原因，目前，研究者主要通過開發屏蔽劑來弱化木質素-纖維素酶分子間的相互作用，進而達到減少無效吸附以及提高木質生物質酶水解效率的目的［6，8，54］。下述將從屏蔽劑與木質素相互作用的角度來概述不同類型屏蔽劑的開發和應用效果。

4.1 基于靜電和氫鍵作用的木質素屏蔽劑

Akimkulova等［13］采用Mg2+對木質素進行處理后發現，其可在一定程度上降低木質素對纖維素酶的吸附（見表3）。以單寧酸為木質素模型物，該研究團隊推測，Mg2+可與木質素酚羥基產生螯合作用，進而降低纖維素酶組分與木質素酚羥基間的氫鍵作用；同時，Mg2+也可能與部分酚羥基中的氫質子發生交換，減少木質素表面的負電荷，從而削弱木質素與纖維素酶分子間的靜電吸引作用。當向SPORL預處理固體基質酶水解體系中添加Ca2+后，研究者發現，酶水解液中纖維素酶的穩定性和活性顯著提高；由此推測Ca2+可與木質素磺酸鹽（LS）形成表面負電荷較低的復合物，降低LS大分子間的靜電排斥，促使LS自身通過氫鍵等作用發生絮聚沉淀，進而減少木質素對纖維素酶的無效吸附［8，55-56］。

表3 木質素屏蔽劑對預處理固體基質酶水解的影響Table 3 Effects of lignin-blocking agents on enzymatic hydrolysis of pretreated solid substrates

此外，離子型表面活性劑（如LS和十六烷基三甲基溴化銨（CTAB））也被開發為木質素屏蔽劑。例如，Wang等［27］發現，將LS添加到酶水解體系中，木質素對纖維素酶的吸附量從182 mg/g降至88 mg/g，纖維素酶水解效率提高了約30%。這是因為，LS可吸附于木質素上，增加LS-木質素復合物的電負性，進而通過靜電排斥作用減少木質素對酶的無效吸附。進一步將聚乙烯醇（PEG）修飾于LS上，研究者發現，LS-PEG可通過靜電排斥等作用分散纖維素酶的聚集狀態，進而提高木質纖維素的酶水解效率，且其作用效果與LS相對分子質量和磺酸根含量均有關［57-58］。此外，將LS加入酶水解體系后，研究者還發現，如繼續添加CTAB，二者具有協同作用，CTAB可降低LS表面負電荷，促進LS在預處理固體基質殘余木質素表面的吸附，強化木質素與纖維素酶的靜電排斥作用，最終提高SPORL預處理固體基質酶水解效率［59］。

4.2 基于疏水作用的木質素屏蔽劑

研究者發現，部分屏蔽劑主要通過疏水作用屏蔽木質素。Castanon等［34］和Eriksson等［12］先后采用非離子表面活性劑吐溫80和PEG來屏蔽木質生物質預處理固體基質表面的木質素，纖維素酶水解效率得到顯著提高（30%~50%）。近期，Cai等［35］利用兩親性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作為添加劑，在低酶用量（3 FPU/g聚葡萄糖）條件下，桉木稀硫酸預處理固體基質中纖維素的酶水解效率從~30%提高到70%。研究者認為，吐溫80和PVP等非離子型表面活性劑主要通過疏水作用與木質素結合，被吸附的屏蔽劑可在木質素表面發生重排，其親水基團（醚鍵）暴露于水相，所形成的水化層可抑制木質素對纖維素酶的無效吸附［6，11-12，35］。

盡管非生物基木質素屏蔽劑（如金屬離子和表面活性劑等）可通過疏水和靜電等作用有效緩解木質素對纖維素酶的不利影響，但其具有廢液難以處理以及不具生物兼容性等缺陷［62-63］。因此，研究者進一步將動植物蛋白開發為生物基木質素屏蔽劑。

因對酶水解效率具有明顯的促進作用，牛血清蛋白（BSA）常被用作生物基木質素屏蔽劑。例如，添加一定量BSA至酶水解液中，諸多酸法預處理固體基質中纖維素的酶水解效率得以顯著提高［10，60-61，64-65］。這主要是由于，基于蛋白疏水區域與木質素的疏水作用，BSA可選擇性屏蔽固體基質表面的木質素。大量研究［10，16，60-61，64］發現，酸法預處理固體基質對纖維素酶和BSA均具較強的吸附能力，但純纖維素（如微晶纖維素Avicel）僅對纖維素酶產生吸附。這表明，在選擇性屏蔽預處理固體基質表面木質素的同時，BSA將不會影響纖維素對酶的可及性［11］。在實驗研究方面，盡管BSA具有一定的應用價值（如減弱木質素的無效吸附），但商品BSA主要來源于牛血清，其價格昂貴，不具備工業化應用的潛在可能性［10，66］。酪蛋白也被用于木質素屏蔽劑制備，作為動物蛋白，其也存在成本較高的缺陷。

近期，研究者進一步將部分廉價植物蛋白開發為木質素屏蔽劑。本研究團隊發現，廉價脫脂豆粉中水溶性大豆蛋白（SP）具有顯著提升水熱預處理固體基質酶水解效率的作用［60，64］。添加80 mg/g聚葡萄糖的SP后，水熱預處理竹子、桉木及馬尾松固體基質中纖維素酶水解效率從對照樣品的57%、54%和45%分別增加至87%、94%和86%［60］。添加SP后，達到相近的酶水解效率（如80%~90%），纖維素酶用量可減少4~8倍，這將顯著降低酶水解的成本。與此類似，本研究團隊［61］還發現，脫脂花生粉中水溶性花生蛋白（PP）具有與SP相似的作用效果，這進一步擴大了廉價生物基木質素屏蔽劑的選擇范圍?；趯γ杆獾孜锛暗鞍椎谋碚?，研究者初步認為，SP和PP主要通過疏水和氫鍵等作用力吸附于木質素上，被吸附的蛋白分子的親水區則裸露在水相中，形成水合層后，其可降低木質素對纖維素酶的吸附［6，60-61］?？梢?，此作用機制與非離子表面活性劑（如吐溫80和PVP等）屏蔽木質素的過程具有相似之處，但SP和PP等蛋白與木質素間是否存在離子-π作用還有待進一步證實。

5 結語及展望

高效制備可發酵糖（如葡萄糖）是開發纖維素基燃料化學品的基礎。然而，木質素對纖維素酶的無效吸附嚴重抑制了酶催化水解纖維素制備葡萄糖的效率。目前，屏蔽劑是克服木質素對纖維素酶不利影響的最簡單、廉價的方法。但木質素與纖維素酶分子結構復雜，兩者間相互作用的機制較為復雜，這也在一定程度制約了高效、綠色屏蔽劑的開發。前期研究發現，木質素與纖維素酶間存在靜電、疏水、氫鍵和陽離子-π作用，但關于“木質素與纖維素酶間陰離子-π、π-π堆積或p-π共軛等非共價相互作用”等方面的報道仍然較少。同時，纖維素不同酶組分與木質素官能團對特定作用力的影響也有待進一步深入探索。因此，仍需從不同角度、采用不同手段來系統揭示木質素與纖維素酶間的非共價作用機制。

利用納米力學等微觀分析手段以系統解析木質素與纖維素酶間的作用機制，目前還需繼續探索研究以下關鍵問題：①明確纖維素酶主要組分外層氨基酸殘基上帶電基團（如—NH3+和—COO-等）與木質素苯基基團間的陽離子-π和陰離子-π作用；②探索分析木質素苯環所連接官能團（苯環、酚羥基和甲氧基等）對離子-π作用的影響；③辨明非離子-π作用（如π-π堆積和p-π共軛效應）對木質素與纖維素酶間疏水和氫鍵作用的強化機制。研究這些問題將不僅有利于系統揭示木質素與纖維素酶間的非共價作用體系，也可為新型木質素屏蔽劑的定向開發以及酶和木質素分子結構的精準調控奠定堅實理論基礎，有利于推動纖維素燃料乙醇的產業化發展。