經典Wnt信號通路與腫瘤免疫耐受的研究進展

霍迪妮，聶小博

(河南大學基礎醫學院，河南 開封 475004)

經典Wnt(整合酶基因與無翅基因)信號通路又稱為Wnt/β聯蛋白信號通路，在進化過程中高度保守，通過調控細胞的增殖、分化、凋亡等過程在胚胎發育、組織穩態和組織修復過程中發揮重要作用[1]。經典Wnt信號通路轉導異常與諸多疾病的發生和發展有密切關系，其中與惡性腫瘤的關系一直是腫瘤學研究領域的熱點方向。經典Wnt信號通路中關鍵組成分子發生基因突變或表觀遺傳學修飾均會導致其信號轉導失調，進而促進惡性腫瘤的發生、進展、耐藥及復發。近年來，隨著腫瘤免疫學的興起，其在腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)中的調節作用也引起了人們的日益關注。經典Wnt信號通路已被證明通過調控樹突狀細胞、T細胞和腫瘤細胞等參與癌癥免疫周期的各個階段[2]。雖然免疫治療尤其是免疫檢查點阻斷療法已在惡性腫瘤治療中取得了很好的效果，但部分患者對于免疫治療的初始反應低下或長期治療后產生耐藥，這均與經典Wnt信號通路異常有一定關系[3]。因此，聯合應用Wnt調節劑有望改善TME，增強免疫治療的效果。 現就經典Wnt信號通路與腫瘤免疫耐受的研究進展予以綜述。

1 經典Wnt信號通路的轉導機制

目前在人類中已鑒定出19種Wnt蛋白分子[4]。Wnt蛋白在出細胞前必須經過棕櫚?；揎?，此過程依賴?；D移酶Porcupine(PORCN)的作用[5]。Wnt蛋白以自分泌或旁分泌方式與靶細胞膜表面的Frizzled(G蛋白偶聯受體家族成員)受體以及輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein,LRP)5/6結合。其中Frizzled受體胞外半胱氨酸結構域的N端是Wnt 蛋白的主要結合部位[6-7]。Wnt與Frizzled和LRP5/6結合后形成的復合物會募集細胞質中的Dishevelled蛋白(一種大多數Wnt通路介質)[8]，并通過Dishevelled蛋白特殊的結構域招募軸蛋白并激活軸蛋白-糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)復合物，促進GSK-3對LRP6的磷酸化修飾[9]，進而抑制由軸蛋白、結腸腺瘤性息肉病(adenomatous polyosis coli，APC)蛋白、GSK-3β和酪蛋白激酶1α等組成的降解復合體的活性，導致β聯蛋白在細胞質中蓄積并進入細胞核與轉錄因子T細胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴增強因子結合，激活一系列與細胞增殖、分化等過程相關的靶基因轉錄[10]。當Wnt蛋白缺乏時，胞質中游離的β聯蛋白會被降解復合體中的激酶磷酸化修飾，并通過這些磷酸化位點與E3泛素蛋白連接酶亞基即β-轉導素重復序列包含蛋白結合，進而被蛋白酶體降解[11]，此時下游靶基因的轉錄受到抑制。

2 經典Wnt信號通路轉導異常與惡性腫瘤的發生

經典Wnt信號通路中起抑制作用的組分發生失活性突變或起信號轉導作用的組分發生激活性突變均會導致該通路的異常激活，促進惡性腫瘤的發生和發展。APC蛋白和軸蛋白是降解復合體中的關鍵組分[12]，其編碼基因的失活性突變會導致β聯蛋白的過度蓄積及下游癌基因的過度轉錄，誘導正常細胞的惡性轉化或腫瘤細胞的惡性增殖[13]。在大多數結直腸癌組織中可以檢測到APC基因的失活性突變，且這些突變在結直腸癌早期已經發生[14]，然而目前尚不清楚這些突變發生的原因。此外，在部分肝細胞癌及肝母細胞瘤組織中可以檢測到Axin 1和Axin 2基因的失活性突變[15]?；谌祟惏┌Y基因組數據庫的一項研究發現，子宮內膜癌、肝癌和結直腸癌組織中β聯蛋白編碼基因的激活性突變發生率均較高，且突變主要發生在編碼N端區域的第3個外顯子附近[16]，然而該基因突變的頻率在其他類型的惡性腫瘤中很低。惡性腫瘤的發生和進展也與經典Wnt信號通路中關鍵組分或其調控分子編碼基因的DNA甲基化或共價組蛋白修飾等表觀遺傳學改變導致的信號轉導異常有關[17]。例如，分泌型脆性相關蛋白1和β聯蛋白抑制基因3均是經典Wnt信號通路的抑制性調控因子，前者基因啟動子區域的高甲基化會導致其表達水平降低，失去對Wnt蛋白的抑制作用，促進非小細胞肺癌細胞的惡性增殖[18]。β聯蛋白抑制基因3的二價組蛋白修飾也會降低其表達水平，失去對β聯蛋白和經典Wnt信號通路的抑制作用。在結直腸癌組織中可以檢測到β聯蛋白抑制基因3二價組蛋白修飾水平的升高及表達水平的明顯降低[19]。因此，闡明經典Wnt信號通路轉導異常發生的分子機制對于惡性腫瘤的靶向治療具有重要意義。

3 經典Wnt信號通路異常與免疫監測的破壞

經典Wnt信號通路不僅能夠調控造血干細胞的自我更新和祖細胞的增殖，還可以調控胸腺T細胞的發育過程[20]。此外，經典Wnt信號通路的激活有利于記憶性CD8+T細胞的生成，強化免疫系統對抗病原體的能力[21]，這對于維持免疫系統穩態至關重要。然而，經典Wnt信號通路異常激活會通過調節免疫細胞參與腫瘤免疫，協助腫瘤細胞逃避免疫監視，并引起腫瘤對免疫治療產生耐藥。

3.1經典Wnt信號通路異常促進免疫耐受 TME是指腫瘤細胞生成和生活的微環境。腫瘤細胞與TME之間復雜的相互作用對于腫瘤的發展、轉移以及治療反應至關重要。TME中除了含有腫瘤細胞，還包括其他類型的細胞，如成纖維細胞、免疫細胞和脂肪細胞等，以及腫瘤血管、淋巴管和細胞外基質成分，同時還存在一些細胞因子、生長因子和趨化因子[22]。免疫耐受是腫瘤細胞逃避免疫監視的主要方式。經典Wnt信號通路異常激活會在一定程度上影響TME中樹突狀細胞的成熟與激活。有研究表明，β聯蛋白缺失會導致樹突狀細胞表面共刺激分子表達水平增加以及共抑制分子表達水平降低，增強抗腫瘤免疫[23]。相反，激活TME中樹突狀細胞的β聯蛋白會誘導免疫調節因子的產生，促進調節性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)的分化，介導免疫抑制；同時通過抑制炎癥細胞因子的產生抑制效應T細胞的分化，促進免疫耐受[24]。其中，樹突狀細胞中的免疫調節因子視黃酸由維生素A代謝而來，腫瘤細胞會激活樹突狀細胞中的β聯蛋白，β聯蛋白與TCF4結合后會誘導維生素A代謝酶的表達，在該酶作用下生成的視黃酸能夠驅動Treg細胞的分化并限制效應T細胞[23]。同樣，免疫調節酶吲哚胺2，3-雙加氧酶-1也會促進樹突狀細胞的耐受及Treg細胞的發育。有研究發現，黑色素瘤來源的Wnt5a依賴于β聯蛋白的作用誘導樹突狀細胞中吲哚胺2，3-雙加氧酶的表達[25]。此外，樹突狀細胞中的β聯蛋白的激活會促進哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白依賴的白細胞介素-10產生，抑制CD8+T細胞的交叉啟動。樹突狀細胞中β聯蛋白的激活對于維持克隆擴增的CD8+T細胞也具有重要意義，說明β聯蛋白對處于不同發育階段的CD8+T細胞有不同的調節作用[26]。

3.2經典Wnt信號通路異常抑制T細胞的浸潤 TME會降低細胞毒性T淋巴細胞的浸潤，這也是腫瘤細胞逃逸免疫監視的機制之一。β聯蛋白信號活化能夠通過誘導轉錄激活因子3的表達干擾CC趨化因子配體[chemokine (C-C motif) ligand,CCL]4的生成，抑制CD103+樹突狀細胞的浸潤[27]。而CD103+樹突狀細胞會產生CXC趨化因子配體[chemokine (C-X-C motif) ligand，CXCL]9和CXCL10，這對于TME招募CD8+效應T細胞是必需的[28]。有研究發現，β聯蛋白對于CXCL9和CXCL10的表達也具有調節作用，β聯蛋白反應轉錄抑制因子14是一種β聯蛋白/TCF抑制劑，能夠上調大腸癌細胞中CXCL9/10/11的表達，促進T細胞浸潤[29]。此外，在攜帶β聯蛋白編碼基因激活型突變的肝癌中發現，β聯蛋白通過下調CCL5的表達導致樹突狀細胞的募集缺陷，損害T細胞活性，進而抑制機體的抗腫瘤免疫反應并促進免疫逃逸[30]，而TME中CD103+樹突狀細胞和T細胞的浸潤減少正是非T細胞炎癥性腫瘤對免疫檢查點阻滯和過繼性T細胞轉移等免疫治療產生耐藥性的主要機制[31]。細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4抑制劑和程序性細胞死亡受體1(programmed cell death receptor 1，PD-1)抑制劑/程序性細胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)抑制劑是目前最主要的兩類免疫檢查點抑制劑，通過阻斷癌細胞表達的免疫檢查點與T細胞之間的相互作用抑制免疫耐受及免疫逃避的發生，增強T細胞的活性，使機體產生更加有效的抗腫瘤免疫反應。因此，細胞毒性CD8+T細胞浸潤程度越高的惡性腫瘤對免疫檢查點阻滯治療的反應也越強[32]。有研究發現，聯合阻斷PD-1/PD-L1和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4陰性共刺激通路可以增強B16黑色素瘤TME中CD8+效應T細胞的浸潤，使TME向炎癥性轉變，并減少Treg細胞及髓源性抑制細胞的數量，加強免疫治療效果[33]。雖然免疫檢查點阻斷療法為癌癥患者帶來新的希望，但目前只有部分患者從中獲益，而且某些對治療有反應的患者也會出現繼發性耐藥[34]，這些現象已被證明與腫瘤細胞中的β聯蛋白信號的過度活化有關[35]。

4 經典Wnt信號通路調節劑在腫瘤免疫治療中的應用

由于經典Wnt信號通路的異常激活與腫瘤細胞逃避免疫監視密切相關，其靶向藥物能夠增強腫瘤的免疫治療。目前靶向經典Wnt信號通路的抑制劑主要有4類：配體受體抑制劑、PORCN抑制劑、端錨聚合酶(tankyrase，TNKS)抑制劑和β聯蛋白抑制劑。有研究發現，Wnt3a中和抗體能夠促進樹突狀細胞成熟并誘導腫瘤特異性CD8+T細胞的增殖及抗腫瘤效應，逆轉TME中的免疫抑制，恢復免疫監視，進而抑制荷瘤小鼠的腫瘤進展[36]。磷酸源生萘啶是一種新型PORCN抑制劑，通過增加TME中CD8+T細胞浸潤抑制腫瘤的進展，但磷酸源生萘啶與DKN-01[一種抗DKK1(Dickkopf-1)抗體]聯合應用是否會增強臨床前卵巢癌患者對免疫檢查點阻滯治療的反應，仍需要進一步研究[37]。Wnt 974能夠抑制Wnt配體的分泌，在體內和體外均可以干擾Wnt信號通路，對小鼠乳腺癌模型和人頭頸鱗狀細胞癌模型均有顯著的抑制作用[38-39]。一項針對晚期實體腫瘤患者的Ⅰ期臨床研究發現，Wnt 974還能夠增強免疫檢查點抑制劑的活性[40]。此外，PORCN抑制劑治療黑色素瘤荷瘤小鼠能同時增強樹突狀細胞捕獲和交叉呈遞腫瘤抗原的能力，并通過調控樹突狀細胞功能增強腫瘤特異性T細胞的功能[24]。TNKS抑制劑能夠抑制細胞中軸蛋白的降解，穩定降解復合體的功能并增強其對β聯蛋白的降解作用，抑制經典Wnt信號通路轉導[24]。TNKS抑制劑 XAV-939和PORCN抑制劑Wnt-C59均可以降低腫瘤細胞刺激誘導的骨髓源性肌成纖維細胞中PD-L1的表達，進而抑制PD-L1治療耐藥的發生[41]。研究發現，聯合應用XAV-939可以增強抗 PD-L1抗體治療骨髓源性肌成纖維細胞混合瘤的效果，并顯著提高TME中CD8+T細胞的比例[41]。另有研究發現，黑色素瘤小鼠接受XAV-939治療后體內的Treg細胞數量減少，而CD4+T細胞與CD8+T細胞的浸潤增加，腫瘤的生長速度受到抑制[23]。另一種新型TNKS抑制劑K-476也被證明通過上調CCL3、CCL4等趨化因子的表達增加CD8+T細胞的浸潤，提高免疫檢查點抑制劑的療效，且與XAV-939相比具有更高的選擇性和安全性，是一種具有應用前景的新型治療藥物[42]。此外，PKF115-584(一種β聯蛋白/TCF4抑制劑)能夠抑制小鼠模型中白細胞介素-10的生成，恢復樹突狀細胞的免疫活性并激活T細胞[43]。因此，聯合應用經典Wnt信號通路拮抗劑和免疫檢查點抑制劑具有協同作用，能夠增強腫瘤免疫治療的效果。

雖然目前的多數研究認為激活經典Wnt通路可促進腫瘤的惡性進展，但也有研究發現，過表達β聯蛋白能夠降低腫瘤的自我更新能力，減輕腫瘤負擔并提高患者的生存率[44]。目前研究較多的Wnt激動劑包括抗DKK1(經典Wnt信號通路抑制因子)單克隆抗體和GSK-3抑制劑。DKK1通過與LRP5/6結合干擾其正常的信號轉導。然而，DKK1會通過靶向抑制β聯蛋白誘導髓源性抑制細胞積聚進而抑制T細胞反應，導致免疫抑制性TME的形成[45]。此外，DKK1也會協助潛伏性癌細胞下調自然殺傷細胞激活因子，促進免疫逃逸[46]。相反，中和DKK1能夠減少髓源性抑制細胞的數量并通過促進T細胞的募集和激活改善TME的免疫活性，抑制腫瘤的生長[45]。DKN-01是特異性靶向DKK1的人源化IgG4單克隆抗體。目前，單獨或聯合應用DKN-01治療晚期難治性膽管癌、晚期食管胃癌以及卵巢癌的相關研究正在進行中[47-49]。在免疫檢查點阻滯治療前使用PORCN抑制劑和DKK1抑制劑能夠改善免疫環境，增加卵巢癌對免疫治療的敏感性[37]。另有研究發現，聯合應用mDKN-01(一種新型抗DKK1單克隆抗體)可以增強PD-1抗體對黑色素瘤的治療效果[50]。GSK-3抑制劑是另一類Wnt激動劑，具有抗腫瘤和促進免疫反應的雙重作用。此類抑制劑不僅能夠促進自然殺傷細胞的成熟，增強其免疫功能[51]，也可通過激活經典Wnt信號通路促進CD8+記憶干細胞的生成，進而發揮更強的免疫作用[52]。GSK-3的小分子抑制劑已被證明能夠降低PD-1的表達，增加CTL的殺傷作用[53]。一項基于小鼠B16黑色素瘤的研究表明，雖然GSK-3抑制劑羅布麻寧的抑癌效果與抗PD-1抗體基本相同[54]，但可以避免低應答率以及耐藥性的發生[55]。因此，適度激活經典Wnt通路也有益于腫瘤的免疫治療。然而針對某種特定類型的惡性腫瘤，選用經典Wnt通路激動劑還是抑制劑才能發揮增強免疫治療的效果仍需要更多研究才能確定。

5 小 結

異常激活的經典Wnt信號通路通過破壞機體免疫監測，促進腫瘤細胞逃避進而抑制免疫系統的抗腫瘤功能。Wnt通路調節劑已被證明可以增強機體的抗腫瘤免疫能力，其中一些藥物甚至可以減少免疫治療耐藥性的發生，增強治療效果。然而，目前的多數研究結果是基于細胞和動物實驗得到的，其臨床治療效果及安全性還需要更多評價，且由于經典Wnt信號通路對于免疫系統的調控過于復雜，選用經典Wnt信號通路激動劑還是抑制劑才能發揮最佳的輔助免疫治療效果仍需要進一步明確?？傊?，靶向Wnt信號通路無論是單獨應用還是與腫瘤免疫治療、放療或化療等方法聯合應用均是頗具應用前景的腫瘤治療策略。