細胞外囊泡在骨關節炎中作用及治療研究進展

章川，李松軍

(遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院骨一科，廣東 珠海 519100)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種以軟骨退變、軟骨下骨硬化、骨贅形成以及滑膜炎癥為特征的退行性關節疾病，可導致疼痛、畸形和關節功能障礙。臨床治療主要包括藥物療法、物理療法和手術療法，以及其他基于緩解疼痛的綜合療法，但上述治療僅能夠一定程度緩解疼痛，改善關節功能，無法從根本上逆轉膝關節進一步退變的進程。近年來，細胞外囊泡(extracellular vesicies，EVs)在組織工程和再生醫學領域的研究進展引起了廣大學者的極大關注，并成為再生醫學中控制炎癥、修復損傷、促進再生等研究的新領域[1]。EVs包括外泌體(exosome，Exo)、微囊泡和凋亡小體，是細胞分泌傳遞生物信號的納米級細胞間信使。EVs在OA軟骨形成和軟骨再生中具有潛在作用，源自軟骨細胞的EVs可在體外誘導祖細胞和干細胞分化為成熟的軟骨細胞，這被認為是修復軟骨損傷最有希望的治療方法[2-3]。EVs還可提高抗炎和免疫調節細胞因子水平，并降低炎癥細胞因子水平，因此，應用來自間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)的EVs治療OA具有巨大潛力[4]。目前已知EVs在OA中具有一系列生理功能和病理作用，但其促進關節修復和減緩關節退行性病變的機制尚不完全清楚?，F對EVs在OA中作用及治療的研究進展予以綜述。

1 EVs的定義及分類

EVs是異質雙層脂質膜小泡的統稱，直徑通常為30～2 000 nm，其可作為各種生物活性信號分子的載體介導細胞間通信作用，已經成為研究疾病和組織修復的熱點[5]。EVs是含有多種生物活性的分子，包括蛋白質、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)、脂肪和DNA。根據直徑和生物起源途徑可將EVs分為Exo、微囊泡和凋亡小體[6-7]。Exo是最小的EVs，直徑30～150 nm，由多泡核內體產生并隨著隔室和質膜的融合而釋放。微囊泡(既往稱為微粒)直徑50～1 000 nm，其可直接從質膜脫落，與Exo相似，微囊泡可能包含核酸、蛋白質和脂質，且可以將上述信號分子轉運至靶細胞。凋亡小體是目前已知的直徑最大的EVs，直徑超過1 000 nm，在細胞凋亡后期形成[8]。EVs可通過不同的機制與受體細胞進行交流，如通過跨膜蛋白與細胞表面受體相互作用，從而誘導細胞內信號通路，亦可通過與細胞膜直接融合或內吞作用釋放到靶細胞中。未來仍然需要深入了解EVs的生物分子機制，以更好地標記不同類型的EVs。

2 EVs在OA中的作用

2.1EVs在OA中的診斷潛力 EVs是OA病理學和病理生理學的新型生物標志物。OA軟骨與正常軟骨的蛋白質含量存在差異，主要由于OA軟骨中細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分的變化。正常人群關節軟骨囊泡的ECM含量遠高于OA患者，其中包括Ⅱ型膠原、蛋白多糖、雙糖鏈蛋白聚糖，故推測ECM破壞可能使OA患者上述相關蛋白減少，因此可從分子生物學角度對上述蛋白的含量進行檢測，從而更準確地認識OA早期病變。

此外，OA的早期干預可延遲或防止早期OA的進一步發展。EVs作為關鍵的miRNA載體，對細胞間信息交流有重要作用，EVs-miRNA可作為OA的早期診斷標志物。miR-140在軟骨細胞中高表達，對調節軟骨穩態有重要作用，研究發現，OA患者的miR-140表達遠低于正常人群[9]。miR-335-5p是OA保護性基因，可能在OA中發揮重要作用，何偉珍等[10]研究發現，OA患者的miR-335-5p水平低于正常人群。miR-155是一種自噬相關miRNA，在OA中呈高表達，其通過調節自噬相關蛋白的表達抑制OA軟骨細胞自噬[11]。

與miRNA相似，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)不僅是OA的潛在生物標志物，還參與了OA的病程。不同lncRNA可以靶向多種miRNA，如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13、Toll樣受體4、Janus激酶，進而影響軟骨細胞增殖、ECM降解及炎癥反應[12]。lncRNA前列腺癌基因表達標記1(prostate cancer gene expression marker 1，PCGEM1)被認為是OA不同階段的指標。研究顯示，晚期OA滑膜液中Exo lncRNA PCGEM1的表達明顯高于早期OA，表明滑膜中的Exo lncRNA PCGEM1可能是區分早期和晚期OA的有力指標[13]，這為準確診斷OA奠定了重要基礎，并提升了分子水平上OA診斷的準確性，有助于對疾病進展做出更加精準的判斷，并針對其分子水平變化制訂治療方案。

2.2EVs在OA中功能 EVs可以進入軟骨細胞、成纖維樣滑膜細胞和巨噬細胞[14-17]。在膝關節中，軟骨細胞、成纖維樣滑膜細胞和巨噬細胞通過滑液內EVs的相互作用，在OA的發病中發揮重要作用[18-19]。EVs不通過被動擴散侵入細胞，其可被白細胞介素(interleukin，IL)-1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等炎癥介質激活，常用于模擬關節炎環境的細胞培養實驗。此外，OA滑膜細胞周圍透明質酸基質的存在也可以促進EVs的內化，表明透明質酸基質外膜可作為EVs的天然載體[20]。有學者發現，EVs以多種方式影響成纖維樣滑膜細胞和軟骨組織。免疫細胞來源的EVs誘導了軟骨降解蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13)和炎癥介質(IL-6、IL-8、單核細胞趨化蛋白1、單核細胞趨化蛋白2)在OA患者滑膜成纖維細胞中的合成[21]。關節軟骨組織中的關節軟骨囊泡可作為病理性鈣鹽晶體沉積形成病灶[22]。與人滑膜成纖維細胞來源的Exo相比，IL-1β來源的Exo刺激人滑膜成纖維細胞顯著上調關節軟骨細胞MMP-13和解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5的表達，下調Ⅱ型膠原α1和聚蛋白聚糖的表達[23]。用OA滑液產生的EVs治療正常關節軟骨細胞可降低細胞存活和合成代謝基因(COL2、聚蛋白聚糖)的表達，增加TNF-α的表達，并提高MMP-2和MMP-9的活性[24]。Song等[25]研究發現，來源于OA的Exo可使正常軟骨細胞增殖減少、凋亡增加。老年患者OA軟骨細胞產生的EVs增加，這些EVs能夠將衰老特征傳遞給鄰近細胞，并減少前列腺素的產生[26]。此外，EVs可激活免疫細胞，OA患者滑膜細胞來源的Exo使M1型巨噬細胞釋放細胞因子(IL-1β、IL-16)、趨化因子(CC趨化因子配體15、CC趨化因子配體20)和MMP(MMP-7、MMP-12)增加，在OA發病機制中發揮關鍵性作用[27]。

膝關節OA患者滑液來源的Exo可促進淋巴細胞趨化，抑制軟骨細胞增殖[28]。EVs對關節組織結構的不利影響很多，但也有積極作用。中性粒細胞來源的EVs可激活軟骨細胞合成代謝基因COL2A1、SOX9的表達，通過轉化生長因子-β誘導ECM沉積和軟骨保護，減少IL-8和前列腺素E2釋放以及軟骨細胞凋亡[15]。在小鼠模型中，正常條件下培養的原代軟骨細胞來源的Exo能夠延緩OA的惡化，還可誘導巨噬細胞向抗炎M2型巨噬細胞的極化[29]。在體外實驗中，Exo通過增加細胞活力、增強COL2和聚蛋白聚糖表達以及減少MMP-13和解聚蛋白樣金屬蛋白酶-5的表達，延緩IL-1β誘發的軟骨退化，并可恢復線粒體功能。此外，來源于M2型巨噬細胞的Exo可刺激原代軟骨細胞中COL2A1和聚蛋白聚糖的表達[30]。且富血小板血漿來源的Exo可增加經IL-1β處理原代軟骨細胞的增殖和遷移，減少軟骨細胞的凋亡和TNF-α的釋放[31]。

3 EVs在OA治療中的應用

目前OA的主要治療是減輕疼痛、改善關節功能，治療方案包括手術治療及非手術治療。對輕度至中度膝關節OA患者，一般選擇非手術治療，主要包括鎮痛、減重、理療等。對于非手術治療無效的晚期OA患者，可采用手術治療，包括脛骨高位截骨術、人工關節置換術、關節鏡下清理術等。MSC具有旁分泌作用，可合成和分泌多種生長因子，而趨化因子和細胞因子可以極大地影響其相鄰細胞，同時MSC可分泌多種類型的EVs，如微囊泡和Exo。EVs具有緩解疼痛、抑制炎癥、減緩軟骨破壞的作用，未來 EVs聯合自噬相關藥物可能是治療OA的重要方法。

3.1緩解疼痛并抑制炎癥 目前，非甾體抗炎藥和物理療法是緩解OA疼痛的主要治療方法，且兩者聯用效果更佳。He等[32]對碘乙酸鈉誘導大鼠OA模型的研究顯示，骨髓MSC來源Exo關節內注射可有效促進軟骨修復和ECM合成，減輕膝關節疼痛，其中降鈣素基因相關蛋白質水平降低是疼痛減輕的重要因素。Li等[33]的研究顯示，骨髓MSC-Exo可通過消除腰椎小關節OA小鼠模型腰椎小關節軟骨下骨中異常的降鈣素基因相關肽陽性神經和異常的H型血管形成來減輕疼痛；此外，骨髓MSC-Exo可減輕軟骨退變，抑制抗酒石酸酸性磷酸酶表達和核因子κB受體活化因子配體-核因子κB受體活化因子-TNF受體相關因子6信號通路激活，促進軟骨下骨重塑，表明骨髓MSC-Exo可以緩解腰痛的行為體征和腰椎小關節OA的病理過程?？梢?，血管生成的減弱以及軟骨下骨骨侵蝕的減少是緩解腰椎小關節OA疼痛的主要原因，骨髓MSC-Exo可能是腰椎小關節OA的潛在治療方案。

炎癥與OA的發生和發展有關，損傷的軟骨通過釋放免疫細胞分泌的促炎性細胞因子(如IL-1、IL-8和MMP)引發炎癥反應，導致軟骨中ECM破壞[34-35]。因此，早期預防和抑制關節軟骨破壞是阻斷炎癥聯級反應、緩解OA疼痛癥狀的重要目標，但大部分試驗尚處于體外實驗研究階段。來自不同干細胞的EVs對OA炎癥有明確的治療作用。EVs對軟骨細胞有保護作用，Tofio-Vian等[36]將脂肪組織來源的MSC中分離出的EVs進行標記，發現其可減少TNF-α、IL-6、前列腺素E2和一氧化氮等炎癥介質的產生，并增強MMP的活性，發揮抗炎作用。另有研究表明，EVs與活化的滑膜成纖維細胞共培養可下調促炎標志物的表達，并保護關節軟骨細胞免于凋亡[37]。Vonk等[3]的研究表明，當與OA軟骨細胞共培養時，人骨髓源性MSC分泌的EVs可抑制TNF-α介導的環加氧酶2和IL的上調，并可在體外促進軟骨再生。Woo等[38]研究顯示，巨噬細胞極化可抑制炎癥反應，M1型巨噬細胞極化表達大量的促炎介質，如TNF-α、IL-12和IL-1β，MSC分泌的EVs可抑制RAW264.7細胞中促炎性細胞因子(環加氧酶2、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達，并促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞的極化。由此可見，EVs可能在OA的抗炎及減輕疼痛管理中具有重要的應用潛力。

3.2促進軟骨再生與修復 在OA進展中，軟骨損傷及缺失逐漸加重，導致疼痛癥狀和功能障礙越來越嚴重，目前晚期OA階段的軟骨損傷修復仍是臨床OA治療的重大挑戰，EVs可抑制炎癥反應、促進軟骨細胞合成代謝，在OA治療中發揮重要作用。OA中的炎癥和氧化應激作用導致ECM和軟骨細胞破壞和丟失，因此軟骨細胞數量以及ECM生物合成的增加可減少OA相關并發癥的發生。Tao等[39]對miR-155-5p高表達的滑膜MSC-Exo治療OA的效果進行研究，結果表明，在體外不損害ECM分泌的情況下，滑膜MSC-Exo可增強軟骨細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，并在一定程度上預防OA。Wong等[40]對外科手術誘發的兔軟骨缺損模型進行研究顯示，MSC-Exo與透明質酸聯用的效果較單獨使用透明質酸更好，且能夠在12周后誘導持續的軟骨修復。Zhang等[41]的研究證實，向手術誘發的膝關節軟骨缺損大鼠關節內注射MSC-Exo，12周后軟骨和軟骨下骨完全恢復，且修復軟骨組織可與相鄰軟骨組織完全融合。

除促進軟骨細胞增殖外，EVs還具有誘導軟骨細胞分化的潛力。Chen等[42]將軟骨祖細胞-海藻酸鹽植入小鼠皮下后，將從軟骨細胞中提取的Exo移植到被植入部位，植入后12周，大量膠原在穩定的軟骨組織中沉積，提示Exo可促進軟骨形成。Zhu等[43]比較滑膜MSC分泌的Exo與誘導多能干細胞來源的MSC分泌的Exo對OA軟骨損傷的療效，結果顯示，誘導多能干細胞來源的MSC分泌的Exo和滑膜MSC分泌的Exo均可刺激軟骨細胞分化，且誘導多能干細胞來源的MSC分泌的Exo治療OA的效果更佳。Wu等[44]研究發現，髕下脂肪墊干細胞來源Exo可延緩關節軟骨退變、抑制細胞凋亡、增強基質合成、降低體外分解代謝因子表達、提高軟骨細胞自噬水平，有助于維持軟骨穩態。綜上，EVs在軟骨形成過程中具有重要作用，并可進一步提高EVs軟骨的形成效率，但差異表達的EVs在軟骨形成和軟骨修復中的作用仍需更多體內外研究的確定。

4 小 結

EVs在OA發病、進展及治療中發揮關鍵作用，未來在EVs用于OA的轉化研究和治療干預時，可根據現有的診斷和治療進行評估。EVs可通過提高細胞活力、促進細胞增殖來抑制炎癥，誘導組織修復和再生，并預防OA進一步惡化。理論上，EVs可以傳遞與其親代細胞相同的信號，與直接細胞移植相比，EVs提供了更簡單、更安全、更實用、更易控制的解決方案。目前，EVs研究仍處于早期階段，且大多來源于細胞培養，但相關研究仍有一些問題有待明確：①EVs的類型、數量、細胞來源；②EVs在各種關節組織中的穩定性及其在軟骨組織中的運輸；③EVs的細胞識別及內化機制?；贓Vs在OA治療中顯示出的研究及應用潛力，未來需要更多研究評估EVs在OA治療過程中的確切機制。