瓦松總多酚提取工藝及其抗氧化研究

趙 楠，張春楠，李宛澤，張 越，李 旭

(牡丹江師范學院 生命科學與技術學院, 黑龍江 牡丹江 157011)

中草藥飼料添加劑因其高效低毒且無抗藥性等優點受到廣泛關注[1]。多酚可作為飼料添加劑，在改善禽畜腸道菌群方面具有重要作用[2-3]，隨著對綠色產品的需求越來越強烈，植物多酚作為天然抗氧化劑得到人們的青睞[4-5]。瓦松為景天科瓦松屬多年生草本植物，一年生蓮座叢的葉短;蓮座葉線形,先端增大，為白色軟骨質，半圓形；有齒。在我國分布廣泛，因常生長于瓦片之上而得名。研究發現，瓦松含有黃酮類、甾醇類、萜類、多酚等多種化學成分[6-8]，在提高宿主抗氧化、抗病毒、抑菌[9-10]以及增強免疫調節等生物活性方面顯示良好的應用潛力[11-13]。對瓦松有效成分的提取多集中于其多糖[14]、黃酮[15]和三萜[16-17]類成分的研究，鮮少有學者對瓦松內多酚類物質進行提取研究。因此，本文綜合考慮瓦松中其他類成分的研究方法，在單因素考察的基礎上，結合正交試驗，研究最佳多酚提取工藝條件，評價其抗氧化能力，進一步為瓦松在飼料添加劑中的應用可行性提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

中藥瓦松購于亳州市康美中藥城，經鑒定為景天科瓦松屬植物瓦松(Orostachysfimbriatus)，粉碎后過60目篩，備用。中藥精細粉碎機、寧波新芝SB-5200DT(360W)超聲波清洗儀，721型紫外分光光度計，電子天平。沒食子酸對照品，純度大于98%，購于合肥博美生物有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法1.2.1 沒食子酸標準曲線

依據參考文獻[18]，采用福林酚比色法繪制標準曲線。精密稱量10.0 mg沒食子酸，蒸餾水溶解后，轉移至50 mL棕色容量瓶中定容后搖勻，獲得沒食子酸對照品溶液，置于低溫處儲藏備用。取7個10 mL容量瓶標記為1～7號，按標記向容量瓶中依次精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL對照品溶液，加入0.5 mL福林酚溶液，混勻后靜置一段時間，再滴加2 mL 20%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容后于室溫下靜置1 h后，于760 nm處測定溶液的吸光值A。以吸光度值(A)對沒食子酸的濃度(c)進行線性回歸，其回歸方程為A=34.823c+0.013 3，線性相關系數R2=0.999 0，表明其在0.000 2～0.003 2 g/L濃度范圍內具有較好的線性關系。

1.2.2 瓦松總多酚的提取和測定

準確稱取1.0 g瓦松樣品粉末，按照料液比加入定量乙醇溶液，在適宜溫度下進行超聲提取，將得到的提取液于室溫下冷卻后過濾，得到的上清液即為樣品提取液。量取1 mL上清液依次加入福林酚試劑、碳酸鈉溶液，操作方法與“1.2.1”項下相同。根據線性回歸方程，計算瓦松提取液中的總多酚含量，并按照公式(1)計算提取率。

(1)

式中：C為樣品提取液的質量濃度，g/L；V為瓦松總多酚溶液的體積，mL；m為瓦松樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗

以瓦松總多酚提取率為考察指標，測定不同乙醇濃度對總多酚提取率影響，設定條件為10倍量不同濃度乙醇溶液，分別采用40%、50%、60%、70%、80%濃度乙醇溶液，采用超聲裝置于70 ℃下提取70 min；測定不同提取溫度對總多酚提取率的影響，設定提取條件為10倍量50%乙醇溶液，分別在40、50、60、70和80 ℃溫度下超聲提取70 min；測定提取時間對總多酚提取率的影響，設定提取條件為10倍量50%乙醇溶液，70 ℃下分別提取40、50、60、70和80 min；測定料液比對總多酚提取率的影響，設定提取條件為一定體積的50%乙醇溶液，70 ℃下超聲提取70 min，其中料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40 g/mL。

1.2.4 正交試驗

根據單因素試驗結果，對瓦松總多酚提取工藝進行四因素三水平正交試驗優化其參數。以檢測瓦松總多酚提取率為指標，以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、料液比(D)作為影響因素，進行L9(34)正交試驗設計，正交因素水平如表1。

表1 正交試驗因素水平

1.2.5 抗氧化實驗

根據文獻[19]方法，選取不同濃度瓦松總多酚溶液1 mL置于10 mL具塞試管中，再加入水楊酸溶液(10 mmol/L)和硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)各1 mL，混勻后加入1 mL過氧化氫溶液(8.8 mmol/L)，振蕩使之充分混勻后于37 ℃水浴下反應30 min，并于波長510 nm處測定混合溶液的吸光度值A1，空白對照采用蒸餾水代替樣品溶液進行測定得吸光度值A0，吸光度值A2為用蒸餾水代替雙氧水溶液測得，抗壞血酸為陽性對照，根據公式(2)計算瓦松總多酚對羥基自由基的清除率。

(2)

1.3 數據統計及分析

單因素試驗和抗氧化實驗數據通過Origin 9.0進行分析，正交設計試驗結果通過SPSS 22.0軟件進行分析。

2 結果與分析2.1 單因素試驗結果2.1.1 乙醇濃度的影響

作為提取中藥有效成分的常見溶劑，乙醇的濃度往往會對該中藥目標有效成分提取率產生一定的影響。由圖1可知，瓦松的多酚提取率隨著乙醇濃度的提升出現先升高后下降的趨勢，當乙醇濃度達到50%時，多酚提取率達到峰值，后繼續提高乙醇濃度，瓦松總多酚的提取率反而下降。瓦松中多酚的極性較大，乙醇濃度過高，溶劑極性偏小，不利于多酚成分的提取，故選擇乙醇濃度為50%進行考察。

圖1 乙醇濃度對多酚提取率的影響

2.1.2 提取溫度的影響

根據圖2可知，當溫度較低時，在一定范圍內瓦松總多酚提取率較低，隨著溫度逐漸升高，其內的分子運動速度加快，增加了多酚在溶液中的溶解度，因而其提取率隨溫度的升高而增加。但當溫度超過70 ℃時，多酚結構的穩定性降低，破壞其分子結構，故提取溫度設定在70 ℃進行考察。

圖2 提取溫度對多酚提取率的影響

2.1.3 提取時間的影響

在提取過程中，有效成分的溶解與擴散需要一定的時間，當擴散達到平衡時提取完成，長時間的提取容易導致成分降解以及雜質溶出增加。由圖3可知，在瓦松總多酚提取過程中，提取時間從40 min增加到70 min時，提取率隨時間遞增后達到峰值，并在繼續延長提取時間后檢測到提取率明顯下降。因此為保證在得到最大提取量的前提下，選用70 min的提取時間為最適方案。

圖3 提取時間對多酚提取率的影響

2.1.4 料液比的影響

多酚受料液比因素影響下提取率變化結果見圖4，在料液比為1∶10 g/mL時多酚的提取率最大，隨著溶劑用量的增加，提取率反而呈下降趨勢，溶劑量過大導致其他成分溶出增加，降低了瓦松總多酚的提取率。因此選擇提取時料液比為1∶10 g/mL進行考察。

圖4 料液比對多酚提取率的影響

2.2 正交試驗2.2.1 正交試驗結果及分析

以單因素試驗結果為基礎，對瓦松總多酚提取率進行正交試驗，確定其最佳提取工藝。正交試驗結果如表2所示。由表2分析可知，各因素對瓦松總多酚提取率的影響由大到小依次為提取時間(C)>提取溫度(B)>料液比(D)>乙醇濃度(A)，根據k值分析，其最優組合為A1B1C2D2，即10倍量的40%乙醇溶液，60 ℃下超聲提取70 min。由表3分析可知，提取溫度、提取時間和料液比對瓦松總多酚提取率影響顯著(<0.05)，而乙醇濃度對瓦松總多酚提取率影響不顯著(>0.05)。

表2 正交試驗結果分析

表3 方差結果分析

2.2.2 驗證試驗

為驗證正交設計優化后的工藝是否可靠，對提取條件A1B1C2D2進行驗證，即10倍的40%乙醇溶液作為提取溶劑，60 ℃下超聲提取70 min，進行3組平行試驗，得到總多酚提取率分別為13.98%、13.73%和14.16%，其平均值為13.96%，相對標準偏差為1.55%。該結果表示經由正交試驗設計優化后的工藝條件穩定，具有一定的科學性。

2.3 抗氧化實驗結果

由圖5可知，在濃度0.2～2.0 g/L范圍內，瓦松總多酚對羥基自由基清除率隨濃度的增加顯著增長，呈現顯著的正相關，其半數清除濃度(IC50)為0.886 g/L。該結果表明瓦松總多酚對羥基自由基有一定的清除能力，具有一定體外抗氧化活性。

圖5 瓦松總多酚體外抗氧化能力

3 討論

通過超聲輔助乙醇提取法結合單因素及正交試驗，對影響瓦松總多酚提取率的多個因素進行考察并優化工藝，最終確定其最佳提取工藝條件為乙醇濃度40%，提取溫度60 ℃，提取時間70 min，料液比1∶10 g/mL，在此條件下瓦松總多酚提取率達到13.96%，其中提取時間對提取率的影響最大。在抗氧化實驗中，瓦松總多酚對羥基自由基的清除能力與其濃度呈現明顯的正相關，其IC50值為0.886 g/L，該結果表明瓦松總多酚具有良好的抗氧化能力。

超聲輔助提取法[20]是中草藥有效成分常有的提取方法之一，該方法既對提取物質沒有要求也不會影響提取物質的活性和結構，同時還具有操作簡單、易分離等特點，在對中草藥有效成分的提取中廣泛應用，能夠大大節省試驗所需要的時間。對瓦松總多酚的提取工藝研究中，應用超聲輔助乙醇提取法，優化后的工藝方案中不僅可以節約溶劑，而且適當的溫度進行提取不會破壞有效成分的結構。

羥基自由基清除實驗結果表明，瓦松總多酚具有較好的抗氧化活性，其清除自由基能力與濃度呈明顯的正相關。隨著促生長類飼料添加劑的全面退出，提高免疫類中藥飼料添加劑[21]應用的越來越廣泛，本文通過對瓦松總多酚的提取與抗氧化的研究，以期為瓦松作為飼料添加劑提供一定的參考價值。

4 結論

該研究為超聲輔助乙醇法從瓦松中提取總多酚，通過單因素和正交試驗優化，得到總多酚的最佳提取工藝為60 ℃下10倍量40%乙醇溶液超聲提取。在此條件下，瓦松總多酚提取率為13.96%。同時對從瓦松中提取的總多酚進行抗氧化活性研究，多酚對羥基自由基的清除能力與其濃度呈明顯正相關，其半數清除濃度為(IC50)為0.886 mg/mL，呈現出良好的抗氧化性。