賴氨酰氧化酶家族蛋白質與胃癌相關性的研究進展

熊 偉，李 彬，王播勇，劉如愛，姜 北，自加吉，周靜華*

（1.大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000；2.云南省高校臨床生物化學重點實驗室，云南 大理 671000；3.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室，云南 大理 671000）

胃癌是嚴重威脅人類健康和生命的消化系統惡性腫瘤之一，其病死率在全球范圍內排惡性腫瘤致死率的第3位〔1〕。雖然近年來胃癌的臨床診療得到了迅速發展，但術后患者的預后非常差。由于腫瘤侵襲和轉移，晚期胃癌患者的5年生存率遠低于10%〔2〕。因此，有必要了解胃癌發生發展的調控機制，以確定有效的臨床治療靶點。目前，越來越多的研究表明，賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）家族蛋白質在多種惡性腫瘤發生發展過程中發揮調控作用，但其在胃癌中的具體作用及分子機制尚不完全清楚。本文就LOX家族各個成員與胃癌發生和發展的相關性作一綜述，以期發現可用于胃癌治療的LOX家族蛋白質成員的特異性抑制劑。

1 LOX家族蛋白質的概述

LOX家族蛋白質是一類分泌型銅依賴性胺氧化酶，具有催化彈性蛋白和膠原蛋白在細胞外基質（extracellular matrix，ECM）共價交聯的作用。LOX催化ECM彈性蛋白和膠原蛋白中賴氨酸和羥賴氨酸殘基的氧化脫氨基反應，產物形成分子間和分子內交聯，這種分子間縮合將彈性蛋白或膠原蛋白的可溶性單體轉化為ECM中的不可溶性纖維，并能抵抗非特異性蛋白水解酶所引起的彈性蛋白分解和膠原溶解，從而起到穩定ECM的作用〔3-4〕。人類有4種LOX同工酶，與LOX具有部分結構同源性，即賴氨酰氧化酶樣蛋白1~4（lysyl oxidase like 1~4，LOXL1~4），這5個成員共同構成LOX蛋白家族〔5〕。人類LOX家族蛋白的編碼基因分別定位于5、15、8、2和10號染色體上〔6〕。其中，LOX基因編碼的mRNA開放閱讀框最短，編碼417個氨基酸，而LOXL2基因編碼的mRNA開放閱讀框最長，編碼774個氨基酸〔7〕。LOXL1~4蛋白分別與LOX蛋白具有85%、58%、65%和62%的同源性。見表1。LOX家族成員都具有催化活性。5個家族成員的C端區域具有95%的同源性，由高度保守的205個氨基酸組成，該催化區域包括銅結合位點、賴氨酸酪氨?；珰埢图毎蜃邮荏w樣結構域〔8〕，對它們的生物活性至關重要。然而，這些家族成員的N端序列卻是多樣性的，LOX和LOXL1蛋白含有前結構域，LOXL2~LOXL4蛋白各自含有4個富含半胱氨酸結構域的清道夫受體，這可能決定它們的亞細胞定位或介導蛋白質-蛋白質相互作用〔9-10〕。

LOX家族蛋白質的表達具有高度組織特異性。LOX蛋白在胎盤、睪丸、心臟、肺、腎臟和子宮中高表達，而在肝臟和大腦中只有很低的表達〔11〕；LOXL1蛋白在胚胎、肌肉、腎臟、心臟、肺和胰臟中高表達，但在肝臟和大腦中的表達也相對較低〔11〕；LOXL2蛋白在胎盤和子宮等組織中的表達很高，在肝臟和大腦中的表達也很低〔12〕；LOXL3蛋白在睪丸、脾臟、前列腺中高表達，在胚胎中的表達居中，在肝臟中幾乎不表達〔13-14〕；LOXL4蛋白是整個蛋白家族在肝臟中唯一高表達的成員〔15〕。見表1。

2 LOX及LOXL1~4蛋白與胃癌發生發展的相關性

2.1 LOX蛋白與胃癌發生發展的相關性胃癌是發展中國家中發病率較高的消化系統惡性腫瘤之一〔16〕。在胃癌組織中檢測到LOX基因mRNA的表達水平顯著高于鄰近的正常胃組織，并且與腫瘤浸潤深度、淋巴結狀態和T、N、M分期有關〔17〕。Kasashima等〔18〕發現胃癌細胞和組織中的LOX基因mRNA和蛋白質在缺氧條件下的表達水平顯著高于常氧條件下的表達水平。此外，LOX蛋白的表達水平與胃癌患者的浸潤深度、腫瘤分化、淋巴結轉移、淋巴浸潤、靜脈浸潤、腹膜轉移等具有顯著相關性，提示LOX基因高表達的胃癌患者預后不良〔19〕。LOX蛋白與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在胃癌不同進展期中的表達呈正相關，因此可以推測兩者在胃癌浸潤和轉移的過程中具有相互協同作用，可能是由于VEGF的異常表達，引起ECM出現異常，進而導致LOX蛋白的異常表達〔20〕。通過siRNA靶向和調低LOX基因能夠抑制缺氧誘導的胃癌細胞上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并降低缺氧條件下胃癌細胞的遷移能力〔18〕。同樣，Peng等〔19〕研究表明，與腫瘤周圍的組織相比，LOX蛋白在胃癌組織中的表達水平也呈現上升的趨勢，并且與漿膜浸潤、遠處和淋巴結轉移以及晚期胃癌有關。此外，局部區域復發患者的LOX蛋白表達水平高于遠處復發患者?？紤]到LOX蛋白與基質硬度之間的關系，研究〔20〕顯示巨噬細胞密度、微血管密度、微血管成熟、基質金屬蛋白酶-9表達水平和Ⅳ型膠原表達水平在過表達LOX基因后均顯著地升高，表明LOX蛋白激活了癌細胞并促進了胃癌的發展。將LOX蛋白與腫瘤標志物癌胚抗原、糖類抗原19-9、糖類抗原125和糖類抗原724結合可以顯著提高預測胃癌淋巴結轉移和腹膜轉移的敏感性〔21〕。然而，一項研究〔22〕表明，由于人類胃癌組織中的DNA甲基化和雜合性喪失，LOX基因表達下調，并且LOX蛋白對胃癌發揮了抑制作用。因此，需要進一步探索LOX蛋白在胃癌發生發展中的作用。

2.2 LOXL1蛋白與胃癌發生發展的相關性LOXL1反義RNA1（LOXL1-AS1）基因位于人類染色體15q24.1上，由10 781個核苷酸和5個外顯子組成。Sun等〔23〕的研究揭示，LOXL1-AS1基因在胃癌組織和細胞中高度表達，LOXL1-AS1蛋白的上調可預測胃癌患者的預后不良，其研究結果表明，LOXL1-AS1基因通過誘導細胞增殖、遷移、EMT和退分化加速胃癌的惡化。LOXL1-AS1基因在體內也能促進胃癌細胞生長與增殖。在功能上，LOXL1-AS1基因作為內源競爭RNA通過分泌miR-708-5p上調轉錄因子USF1。此外，該研究還證實LOXL1-AS1/miR-708-5p/USF1通路在胃癌進展中起促進作用，USF1促進了干細胞標記SOX2的轉錄。

有研究〔24〕顯示，LOXL1基因在胃癌細胞中呈高表達，并且與胃癌預后差顯著相關?；蚣患治鲲@示，LOXL1基因表達與參與EMT過程的基因表達呈正相關。與普通胃癌患者的腫瘤組織和細胞相比，LOXL1基因在腹膜擴散胃癌患者的腫瘤組織和細胞中過表達。LOXL1基因過表達降低E-鈣黏蛋白（CDH1）表達，增加VIM、CDH2、SNAI2和PLS3蛋白的表達，進而促進胃癌細胞的遷移能力。而且過表達LOXL1蛋白的胃癌細胞將它們的形態改變為紡錘狀形式。此外，LOXL1基因mRNA高表達與低分化的組織學類型、淋巴結轉移密切相關，并且是一個預后不良的獨立危險因素〔24〕。還有研究〔25〕表明，LOXL1基因的表達水平在不同臨床病理學特征之間存在差異，在T分期較晚的胃癌患者中，LOXL1基因呈更高的表達水平。LOXL1蛋白可以通過WNT/β-catenin/cyclinD1信號通路促進胃癌細胞的增殖，但并不影響胃癌細胞的侵襲和遷移。以上研究結果提示，LOXL1蛋白在胃癌中主要發揮促癌作用。

2.3 LOXL2蛋白與胃癌發生發展的相關性Zhou等〔26〕在胃癌基質細胞中觀察到LOXL2基因的過表達?；|細胞中LOXL2基因的表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移、淋巴浸潤、靜脈浸潤和腹膜播散顯著相關。多因素回歸分析顯示，基質細胞中LOXL2基因的表達水平可能是胃癌患者總體生存率的獨立預測指標。來自基質成纖維細胞的LOXL2蛋白也促進胃癌細胞的遷移。更重要的是，LOXL2基因高表達是胃癌患者預后不良的指標〔27〕。與正常上皮組織相比，LOXL2基因在原發癌組織中的表達顯著升高，并且與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移顯著相關，預示著胃癌患者的總體預后較差。此外，在與原發性胃癌相關的轉移淋巴結中也檢測到LOXL2基因的表達。shRNA誘導的LOXL2基因沉默和抗LOXL2抗體降低了胃癌細胞的侵襲、黏附和轉移能力。相反，LOXL2基因過表達促進了胃癌細胞的侵襲和黏附。此外，分泌型的LOXL2蛋白通過激活Src/FAK通路促進了胃癌細胞的侵襲和轉移〔28〕。這些發現共同表明，LOXL2蛋白在胃癌中發揮促癌作用。

2.4 LOXL3蛋白與胃癌發生發展的相關性最近對LOXL3蛋白的研究〔29〕發現，除了作為胺氧化酶外，LOXL3蛋白還發揮著各種新的作用。LOXL3蛋白通過與SNAIL（一種參與EMT過程的轉錄因子）發生相互作用，在抑制CDH1基因表達中發揮作用。LOXL3蛋白與核周膜中SNAIL蛋白的相互作用能協同下調CDH1蛋白的表達，從而表明LOXL3蛋白參與腫瘤進展和轉移。此外，SNAIL蛋白Ser11位點的磷酸化受蛋白激酶D1（protein kinase D1，PKD1）調節，PKD1促進LOXL3蛋白的上調及其與SNAIL蛋白的相互作用〔30〕。SNAIL蛋白Ser11位點的磷酸化導致與組蛋白脫乙酰酶1和2（HDAC1和HDAC2）以及LOXL3蛋白結合。磷酸化的SNAIL蛋白與HDAC1和HDAC2形成的復合物在細胞核中穩定，并促進腫瘤增殖標記物的上調，如細胞周期蛋白D1和AJUBA蛋白〔30〕。

LOXL3基因mRNA在心臟、脾臟、子宮、髓質、脊髓和卵巢中的表達水平最高〔14，31〕。LOXL3和LOXL4基因mRNA在侵襲能力強的彌漫型胃癌細胞中表達水平顯著增高。LOXL3蛋白表達于細胞質和細胞核，主要表達于細胞核〔32〕。LOXL3基因表達升高與胃癌浸潤、淋巴和靜脈浸潤以及淋巴結轉移相關。與LOXL3蛋白陰性表達的胃癌患者相比，LOXL3蛋白陽性胃癌患者的臨床結局不佳〔33〕。另外，轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在胃癌細胞中能夠誘導LOXL3蛋白表達上調，表明LOXL3蛋白是TGF-β信號通路的下游分子。然而，仍然需要更多的研究來進一步驗證LOXL3蛋白在胃癌中的致癌作用。

2.5 LOXL4蛋白與胃癌發生發展的相關性LOXL4蛋白具有抑制腫瘤或促進腫瘤，調控細胞發育和衰老，誘導細胞趨化性等作用。LOXL4蛋白在腫瘤發生過程中形成免疫抑制微環境〔34〕。LOXL4蛋白還可以通過外泌體形式促進自身的遷移及上皮細胞的增殖、遷移和血管的形成，導致腫瘤發生侵襲和轉移〔35〕。

目前，LOXL4蛋白被報道為胃癌中的促癌蛋白〔36〕。LOXL4蛋白表達在胃癌組織中高于配對的非癌組織，并且與腫瘤大小、癌浸潤深度、淋巴結轉移和T、N、M分期呈正相關，可用于預測胃癌患者的不良臨床結局。此外，LOXL4基因的表達上調促進了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并通過激活Src/FAK信號通路促進ECM黏附。與此一致的是，調低LOXL4基因對胃癌細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用。TGF-β是腫瘤細胞中LOXL4蛋白表達的關鍵調節因子，它可以誘導LOXL4蛋白的表達。研究〔33〕顯示，TGF-β能夠降低胃癌細胞LOXL1蛋白表達并增加LOXL3和LOXL4蛋白的表達。LOXL4蛋白可能是胃癌的一個獨立的預后標志物和潛在的治療靶點。

3 總結與展望

胃癌對人類健康的危害很大，患者治療效果差和預后差的原因主要有兩個方面:一方面是診斷和發現不及時，大部分患者就診時已是晚期，另一方面是胃癌容易發生浸潤和轉移。已有的研究表明，LOX家族蛋白質各成員調控胃癌發生、發展的各種重要過程，主要發揮促癌作用。這為開發LOX家族蛋白質成員的特異性抑制劑用于治療胃癌提供了可能。值得一提的是，為了充分闡明和理解LOX家族蛋白質在胃癌發生和進展中的作用，仍然需要解決多個問題。目前，大部分的研究解析了LOX家族蛋白質的下游靶點，但LOX家族蛋白質成員如何被上游基因調控以及如何發生蛋白質降解尚不清楚。為了更深入地確定LOX家族蛋白質成員的功能，應建立基因敲入和基因敲除等工程小鼠模型。此外，還需要對抑制LOX家族蛋白質的小分子抑制劑進行高通量篩選，以發現可用于胃癌治療的LOX家族蛋白質成員的特異性抑制劑。