載脂蛋白CI 與腎母細胞瘤疾病分期的相關性分析

陳楓 岳霖琳 張燕萍 劉金平 劉海金 曾林山 陳俊敏

1.贛南醫學院第一附屬醫院小兒外科，江西贛州 341000；2.贛南醫學院第一附屬醫院重癥醫學科，江西贛州 341000；3.廣東省人民醫院贛州醫院（贛州市立醫院）檢驗科，江西贛州 341000

腎母細胞瘤為兒童群體常見腎臟惡性腫瘤類型，對患兒生命健康及成長發育造成了極大影響[1]。因此，早期對腎母細胞瘤進行準確評估具有重要意義。但當前臨床用于評估腎母細胞瘤的指標缺乏良好的特異性及敏感性，故需尋找新的指標對疾病進行診斷評估[2]。隨著臨床研究深入，載脂蛋白CI 在多種疾病診療評估中的應用價值逐漸引起關注，研究發現，載脂蛋白CI 可參與不同病理、生理反應，甚至和惡性腫瘤發病及進展具有密切關聯性[3-4]。但當前關于載脂蛋白CI 與腎母細胞瘤疾病分期關聯性的研究較少，基于此，本研究擬選取腎母細胞瘤患兒50 例，通過設置對照組，探討上述內容。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年8 月至2022 年2 月贛南醫學院第一附屬醫院收治的腎母細胞瘤患兒50 例設為研究組，另選取門診體檢健康兒童20 名設為對照組。研究組中，男27 例，女23 例；年齡3～10歲，平均（6.23±3.11）歲；疾病分期（COG 分期）：Ⅰ期10例，Ⅱ期10 例，Ⅲ期10 例，Ⅳ期10 例，Ⅴ期10 例。對照組中，男11 名，女9 名；年齡2～10 歲，平均（6.05±3.24）歲。兩組患兒的一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。納入標準：①研究組均經病理檢查確診；②研究組既往未采取放化療治療。排除標準：①存在其他良惡性腫瘤者；②存在血液系統、代謝系統及自身免疫系統疾病者；③存在全身性感染性疾病者；④存在精神系統疾病者?；純杭覍僦獣员狙芯?，簽署同意書，且本研究經醫學倫理委員會審批通過（倫理審批號：LLSC-2022041801）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 兩組均在晨起時空腹采集外周靜脈血置于血清分離管中，4℃條件下過夜，離心處理（1000×g，15 min），分別置于不同EP 管，置于-80℃環境保存；研究組瘤體標本均為手術切除或穿刺活檢的新鮮標本，分裝至不同凍存管，液氮速凍處理，置于-80℃環境或液氮罐儲存，經甲醛固定標本，石蠟包埋。

1.2.2 血清載脂蛋白CI 檢測①樣本準備：血清樣本取出后置于4℃環境溶解，4℃離心（1000×g，10 min），取10 μl 稀釋，加入PBS（490 μl），終體積500 μl；反復顛倒混勻，充分稀釋；取稀釋液（10 μl）加入PBS（390 μl），終體積400 μl，置于4℃環境儲存。②試劑準備：將試劑包括前期稀釋后血清樣本緩慢升至室溫；首先實施標準品稀釋，取1 ml 稀釋液加入標準品內，室溫靜置10 min，輕輕搖晃混勻，避免起泡；依據說明書稀釋，隨后依次成倍稀釋標本品，獲取不同濃度樣本，以0 ng/ml 作空白孔；A、B 檢測液快速離心，按1∶100 將對應稀釋液配為工作液。③實驗步驟：設立空白孔、血清樣本孔、標準孔共3 大組；將8 個標準品加入板孔，100 μl/孔；空白孔加入標準品稀釋液100 μl，其余各孔加入100 μl 血清樣本，孔板蓋上覆膜，37℃條件下孵育60 min；廢液去除、甩干，各孔加入100 μl 檢測溶液A 工作液，繼續孵育60 min；廢液去除，各孔加入洗滌液350 μl，室溫孵育1 min，甩干，重復洗板3 次，末次將孔板扣于濾紙，吸干孔內殘留液體；各孔加入100 μl 檢測溶液B 工作液，37℃環境下孵育0.5 h；孔內廢液去除，甩干，洗板5 次，步驟同上；各孔加入90 μl TMB 底物溶液，37℃環境下15 min 避光顯色，各孔加入終止液50 μl，輕敲孔板混勻；檢測孔無氣泡，孔板底無水滴，于酶標儀450 nm 波長下測定各孔OD 值。

1.2.3 瘤體組織載脂蛋白CI 檢測（免疫組化SP 法）取腫瘤組織新鮮樣本，經中性甲醛（10%）固定，石蠟包埋，常規切片；置于烤箱于60℃條件下孵育60 min，避免脫片；經酒精、二甲苯脫蠟，PBS 洗滌5 min/次，共3 次；檸檬酸鹽緩沖液抗原修復15 min，降至室溫，經PBS 浸泡5 min/次，共3 次；室溫下經H2O2（3%）孵育20 min，內源性過氧化物酶封閉，PBS 洗滌5 min/次，共3 次；加入山羊血清封閉液，50 μl/片，室溫封閉0.5 h，甩干加入一抗，50 μl/片，放入濕盒，于4℃環境下過夜；采取PBS 浸泡5 min/次，共3 次；加入偶聯生物素二抗，50 μl/片，于37℃環境下孵育0.5 h，經PBS 洗滌，流程同上；加入鏈霉卵白素（標記辣根過氧化物酶），50 μl/片，于37℃環境下孵育0.5 h，經PBS洗滌，流程同上；DAB 工作液顯色，反應時間5 min，以自來水沖洗，終止顯色反應；蘇木素復染細胞核，50 μl/片，2 min，自來水沖洗，終止染色；經酒精梯度脫水，以二甲苯透明，采取中性樹膠封片，經顯微鏡觀察拍照。

1.3 觀察指標

①比較兩組血清及組織載脂蛋白CI 表達水平。②比較研究組不同疾病分期患者血清及組織載脂蛋白CI 表達水平。③分析血清及組織載脂蛋白CI 表達水平與腎母細胞瘤疾病分期的關聯性。

1.4 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用t 檢驗，多重比較采用LSD-t 檢驗，不符合正態分布者轉換為正態分布后行統計學分析；計數資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman 進行相關性分析，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者載脂蛋白CI 水平的比較

研究組血清載脂蛋白CI 水平為（52.35±10.63）μg/ml，高于對照組的（32.61±9.05）μg/ml，差異有統計學意義（t=7.305，P＜0.001）；研究組的瘤體組織載脂蛋白CI 為（49.79±7.81）μg/ml。

2.2 研究組不同疾病分期患兒載脂蛋白CI 水平的比較

研究組不同疾病分期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。Ⅱ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅰ期患兒，Ⅲ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅱ期患兒，Ⅳ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅲ期患兒，Ⅴ期患兒血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平高于Ⅳ期患兒，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 研究組不同疾病分期患兒載脂蛋白CI 水平的比較（μg/ml，）

表1 研究組不同疾病分期患兒載脂蛋白CI 水平的比較（μg/ml，）

2.3 疾病分期與載脂蛋白CI 的相關性分析

血清及瘤體組織載脂蛋白CI 水平與腎母細胞瘤疾病分期呈正相關（P＜0.05）（表2）。

表2 疾病分期與載脂蛋白CI 的相關性分析

3 討論

腎母細胞瘤為小兒群體常見腎臟惡性腫瘤類型，疾病早期缺乏特異性臨床表現及癥狀，因此早期漏診及誤診率較高[5-7]。同時，不同分期腎母細胞瘤患者生存期限存在顯著差異，且其影響因素較多，包括疾病分期、早期診斷與治療時機等，其中早期診斷對確?；颊呒霸绲玫接行е委?、以此保證疾病治療效果具有積極意義[8-10]。目前，臨床多通過循環miRNAs、促血管生成素-2、缺氧誘導因子-1 等對腎母細胞瘤進行診斷評估，但其血清表達水平易受環境等因素影響，導致其臨床應用存在局限性[11-13]。

載脂蛋白CI 在惡性腫瘤中的檢測價值逐漸得到廣泛關注，當前臨床已經蛋白組學技術自腎母細胞瘤患者血清內提取出載脂蛋白CI，但關于其在腎母細胞瘤患兒血清內表達情況的報道研究尚未得到廣泛證實[14]。載脂蛋白CI 為載脂蛋白家族中最小可溶性蛋白類型，主要于肝臟內合成，僅少部分于小腸等器官內合成，為循環系統內陽離子含量最豐富的蛋白[15]。載脂蛋白CI 可參與高密度脂蛋白與富含甘油三酯的脂蛋白的組建，通過結合于低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白受體，發揮抑制功能。王磊等[16]研究指出，載脂蛋白CI 為肝臟生成的含83 個氨基酸殘基的一種水溶性低分子蛋白質，具備體內脂質代謝調節等多種作用，且載脂蛋白CI 和多種惡性腫瘤間具有密切關聯性，主要表現為在胃癌、子宮內膜癌、前列腺癌及其他惡性腫瘤中均表現為載脂蛋白CI 表達水平異常，表明載脂蛋白CI 在諸多類型惡性腫瘤中均為異常高表達狀態，可能是因惡性腫瘤細胞高代謝狀態對能量具備更多需求，促進機體更多地動員脂蛋白，上調血清內脂蛋白與其組成成分載脂蛋白CI 的表達，但由于載脂蛋白CI 相關的多種類型腫瘤通常發生于成年人群，而在兒童中發病率相對較低，故不影響將載脂蛋白CI 作為腎母細胞瘤重要的診斷評估標志物。

目前，關于載脂蛋白CI 在惡性腫瘤中的表達水平及檢測價值已得到臨床證實，如Shi等[17]研究證實，在非小細胞肺癌患者中，載脂蛋白CI 呈高表達狀態，且隨著疾病分期的增高，其水平呈逐漸增高趨勢，故可用于疾病病情程度的評估，且其在疾病預后預測中具有較高應用價值。Kiebish等[18]研究顯示，在早期前列腺惡性腫瘤、激素抵抗性前列腺惡性腫瘤中，患者載脂蛋白CI 血清表達水平呈逐漸增高狀態，且自正常前列腺組織至高分化前列腺惡性腫瘤，再至低分化及激素抵抗性前列腺惡性腫瘤組織內，載脂蛋白CI蛋白表達也逐漸增高，表明在前列腺惡性腫瘤患者中，載脂蛋白CI 水平越高，則預后越差。本研究結果顯示，研究組血清載脂蛋白CI 水平高于對照組，且不同疾病分期腎母細胞瘤患者血清、瘤體組織載脂蛋白CI 水平存在明顯差異，經相關性分析證實兩者呈正相關（P＜0.05），提示載脂蛋白CI 檢測在腎母細胞瘤中存在較高應用價值，可準確用于評估疾病分期，對指導臨床采取針對性治療具有重要意義。

綜上所述，腎母細胞瘤患者載脂蛋白CI 呈高表達狀態，通過檢測其水平可對疾病分期予以評估，可為臨床制訂或調整干預方案提供一定參考依據，利于保證疾病良好轉歸。但本研究存在一定局限性，即本研究為單中心小樣本研究，因此研究結果是否存在廣泛效力仍需擴大樣本選取范圍、增加樣本量進一步探究證實。