胃癌DNA甲基化亞型及風險預測模型的建立

盧偉，付濤

武漢大學人民醫院胃腸外Ⅱ科，湖北 武漢 430060

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，據統計，2018年全球范圍內新發病例超過100萬，同時有超過80萬病例死亡[1]。由于胃癌早期癥狀不典型、篩查體系不完善，在中國約70%的胃癌病人在確診時已經處于進展期[2]。腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)，包含惡性細胞、腫瘤相關成纖維細胞、基質細胞和免疫細胞等，與腫瘤發生發展、病人預后以及新的治療方案相關[3]。

目前越來越多的證據表明表觀遺傳學的改變包括DNA甲基化，基因組印跡以及其他改變，這些改變可能會導致包括胃癌在內的惡性腫瘤進展[4]。本文旨在探討DNA甲基化對TME的潛在影響，同時建立基于DNA甲基化預后相關差異位點的胃癌分子亞型以及Cox風險預測模型，為胃癌的診療提供一定理論依據[5]。

材料與方法

一、胃癌數據集下載及倫理學申明

癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中胃腺癌(stomach adenocarcinoma，STAD)病人RNA轉錄組數據可從基因組數據共享(Genomic Data Commons，GDC，https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載。所有TCGA-STAD DNA甲基化數據均直接從加利福尼亞大學圣克魯斯分校(UCSC，http://xena.ucsc.edu/public/)下載，其中包括Methylation 27k TCGA-STAD數據集和Methylation 450k TCGA-STAD數據集，并不受倫理審核。

二、臨床數據和DNA甲基化數據的系統分析

下載的TCGA-STAD臨床數據集包括病人的生存時間、生存狀態、性別、T分期、N分期、M分期、病理分期等，通過樣本ID合并病人生存時間、生存狀態及DNA甲基化位點(排除一些標記為“未知”的數據)。對Methylation 450k TCGA-STAD數據集使用“survival” R包進行了Cox回歸分析，得到單因素和多因素獨立預后甲基化位點。

三、構建胃癌甲基化亞型并得出分型與臨床特征的關系

運行一致性聚類對TCGA-STAD數據和多個獨立預后的甲基化位點進行分析，然后將TCGA中胃癌樣本分為不同的DNA甲基化亞型(使用“ConsensusClusterPlus”R包無監督運行1 000次)。同時可以獲得不同的胃癌DNA甲基化亞型病人的預后。通過TCGA-STAD病人樣本ID將分型后的DNA甲基化亞型中的胃癌病人與其臨床特征結合，探索不同DNA甲基化亞型與臨床特征的關系。

四、推算不同DNA甲基化亞型對TME的影響

選擇DNA甲基化水平差異最大的2個亞型，將亞型對應的TCGA-STAD樣本上傳至CIBERSORT(https://cibersort.stanford.edu/)來推斷2個亞型的免疫細胞組成(循環計算1 000次)，由此可以推算DNA甲基化對TME的影響。

五、建立Cox風險預測模型

選擇預后最好同時包含差異位點最多的亞型，取該亞型DNA甲基化差異位點及多因素獨立預后DNA甲基化位點的交集位點，計算風險評分(Risk Score)，計算公式如下：

其中“1”到“n”為所有DNA甲基化差異位點。將450k甲基化芯片中病人標記為“訓練組”(“training group”)，將27k甲基化芯片中病人標記為“對照組”(“test group”)。對訓練組及對照組中的病人進行風險評分，高于訓練組風險評分中位值的病人為高風險組病人，低于訓練組風險評分中位值的病人為低風險組病人。

六、系統性分析

首先本研究采用了R studio軟件(R 3.6.1 version，https://www.r-project.org/)及Perl進行數據分析及作圖。通過TCGA RNA轉錄組數據對P值進行校正得到偽發現率(FDR)，篩選臨界值為FDR<0.05和logFC絕對值>2.000。通過訓練組病人的受試者工作特征(ROC)曲線判斷該模型是否有效[6-8]。

結 果

一、胃癌DNA甲基化亞型的劃分

通過TCGA樣本ID將Methylation 450k TCGA-STAD數據集與樣本對應的生存時間及生存狀態合并，使用Cox回歸分析，得到148個單因素獨立預后相關DNA甲基化位點(P<0.05)和137個多因素獨立預后相關DNA甲基化位點(P<0.05)。根據樣本生存時間、生存狀態和多因素獨立預后相關DNA甲基化位點將TCGA-STAD分為7個DNA甲基化亞型，同時可以獲得DNA甲基化亞型的Kaplan-Meier曲線(P=0.003，圖1A、B)。

二、不同DNA甲基化亞型病人的臨床特征

合并TCGA-STAD臨床數據和DNA甲基化亞型，分析不同甲基化亞型與病理分期、分級(grade)、性別、年齡、TNM分期的關系[9]。結合圖1B及圖2A可認為DNA甲基化水平最高的亞型3病人較DNA甲基化水平最低的亞型7病人預后更好(P<0.05)。由圖2 B～H可知亞型7中≤65歲、G2、M1期、N2期和Ⅳ期病人數量多于亞型3中病人數量。

三、分析不同DNA甲基化亞型病人的免疫細胞差異

CIBERSORT結果提示生存差異最大的亞型3及亞型7的免疫細胞組成中幼稚B細胞(B cells naive)、記憶B細胞(B cells memory)及激活的T細胞CD4+記憶細胞(T cells CD4 memory activated)存在明顯差異(P<0.05，圖3)。

圖1 確定DNA甲基化亞型 A.按DNA甲基化水平差異將TCGA-STAD劃分為7個DNA甲基化亞型；B.不同DNA甲基化亞型的生存率差異(P<0.05)

圖2 不同臨床特征中不同DNA甲基化亞型病人所占比例 A.DNA甲基化與臨床特征關系的熱圖；B.不同DNA甲基化亞型病人年齡占比；C.不同DNA甲基化亞型病人性別占比；D.不同DNA甲基化亞型病人病理分級占比；E.不同DNA甲基化亞型病人病理分期占比；F.不同DNA甲基化亞型病人T分期占比；G.不同DNA甲基化亞型病人N分期占比；H.不同DNA甲基化亞型病人M分期占比

圖3 亞型3病人和亞型7病人免疫細胞浸潤差異

四、建立Cox風險預測模型

通過DNA甲基化分型與預后結果可見亞型3預后最好，取該亞型DNA甲基化差異位點及多因素獨立預后DNA甲基化位點的交集位點計算風險評分，在本文中風險評分=(-1.242×cg12645220表達量)+(-1.432×cg20727114表達量)+(-1.744×cg26535072表達量)，見表1。

表1 DNA甲基化差異位點表達與該位點系數

基于風險評分建立Cox風險預測模型，將TCGA-STAD病人分為高風險組病人和低風險組病人(臨床信息見表2)。ROC曲線下面積(AUC)為0.677，可以認為基于風險評分構建的DNA甲基化Cox風險預測模型能夠有效預測胃癌病人預后(圖4)。訓練組病人及對照組病人的Kaplan-Meier曲線均證明高風險組病人較低風險組病人預后更差(P<0.05)，見圖5A、B。

圖4 DNA甲基化風險預測模型繪制的受試者工作特征(ROC)曲線

表2 TCGA-STAD病人臨床信息(例)

圖5 訓練組和對照組不同風險組病人的預后 A.在訓練組中，高風險組病人較低風險組病人預后更差(P<0.05)；B.在對照組中，高風險組病人較低風險組病人預后更差(P<0.05)

討 論

在以往的研究中，為了預測胃癌病人的預后，通常將胃癌分為4種分子亞型：EB病毒相關型胃癌，微衛星不穩定型胃癌，染色體不穩定型胃癌以及基因組穩定型胃癌[10]。本研究基于DNA甲基化水平差異將TCGA胃癌病人分為7個DNA甲基化亞型。

由于腫瘤生物學行為和免疫反應的異質性和復雜性，應用單一的生物標志物來全面說明和預測腫瘤預后和其對治療的反應是不可靠的。因此，基于多生物標志物的預測模型可能是一種更有效、更準確的工具。本研究依據DNA甲基化預后相關差異位點cg12645220、cg20727114、cg26535072建立了Cox風險預測模型。cg12645220、cg20727114、cg26535072表達的基因分別是PAK7、APBA1、CPT1C。p21活化激酶7(PAK7)屬于PAK族蛋白，參與調節細胞增殖、凋亡、侵襲/遷移和化學抗性，其過度表達或激活可能導致癌癥[11-12]。APBA1與 Munc18-1結合，在突觸小泡的胞吐作用中發揮推定功能，突觸小泡的胞吐作用是突觸小泡胞吐機制的重要組成部分[13]。CPT1C具有該基因的重要旁系同源物是CPT1A在脂質代謝過程中類似的作用，能夠影響CD8+T記憶細胞的生長[14]。CPTI激活脂肪酸氧化，通過產生ATP和NADPH促進癌癥生長，這是癌癥代謝的重要組成部分[15]。所以，CPT1C可能成為癌癥的新治療靶點[16]。

遺傳基因的表觀學改變，尤其是DNA甲基化，已被確定為腫瘤免疫細胞浸潤改變的重要因素[17-18]。本研究證明了DNA甲基化水平高的病人預后好，DNA甲基化水平不同的病人間存在包括幼稚B細胞、記憶B細胞及激活的T細胞CD4+記憶細胞等免疫細胞比例的差異?，F在針對胃癌免疫治療，如程序性死亡蛋白-1(PD-1)等，都是針對T細胞的治療方法[19-20]。B 細胞被認為是體液免疫的主要效應細胞，可以通過分泌免疫球蛋白、促進T細胞反應和直接殺死癌細胞來抑制腫瘤進展[21]。盡管免疫檢查點抑制劑的引入使T細胞相關免疫反應成為治療靶點，但并非所有病人都能從這些治療中受益[22-24]。細胞毒性免疫依賴于特殊效應T細胞，即細胞毒性T細胞，它們具有特定的溶細胞機制，使它們能夠誘導目標死亡，確定靶細胞后，細胞毒性T細胞形成裂解免疫突觸，通過將微管組織中心對接在突觸膜上，制備致死酶溶解裂解顆粒[25-26]。美國食品藥品監督管理局批準了幾種檢查點抑制劑藥物，如抗PD-1派姆單抗等，但并未廣泛應用于臨床胃癌病人[27-28]。針對DNA甲基化位點的免疫治療可能會成為未來胃癌治療方法之一[29-31]。

本研究也具有一定的局限性：首先對TCGA數據庫進行了條件篩選，結果可能出現選擇偏倚。其次，TCGA數據庫中病例為美國公民，因為中美飲食條件、早期篩查體系的不同，所以結果對亞太人群的預測效果可能并不理想。并且由于TCGA數據庫中樣本量的限制，同樣會對研究結果造成影響，在后期仍需要大量獨立樣本進行驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突