一株Triton X-100降解菌的分離鑒定及降解條件優化

王寶任，蘇婷婷，王戰勇

（1.遼寧石油化工大學 石油化工學院，遼寧 撫順 113001；2.沈陽農業大學 生物科學技術學院，遼寧 沈陽 110866）

表面活性劑是一種在低濃度下能夠顯著降低界面張力的物質，具有增溶、分散、乳化的作用，由于其獨特的性質和多樣的功能，廣泛應用于工農業、醫藥、食品、日化等領域[1-2]。但是，若大量使用表面活性劑，則會在環境中積累，造成一定的生態問題。例如，水體中的表面活性劑在魚的內臟和鰓積累，可導致魚類窒息死亡[1]；土壤中的表面活性劑會損傷植物根系，抑制植物的光合作用[3-5]；過量的表面活性劑對人體也有害，可能會導致皮炎和口腔潰瘍等疾病[6-7]。因此，有效清除環境中的表面活性劑，維持生態環境的平衡，保護人體健康，已成為環境工程領域亟待解決的重要任務。治理表面活性劑廢水的方法眾多，但生物降解法是最為高效和安全環保的處理方法[8-9]。

本研究從某化工廠污水處理車間好氧曝氣池的活性污泥中篩選了對非離子表面活性劑TritonX-100具有降解能力的菌株ISB5，對其降解Triton X-100的能力進行了考察。研究結果對表面活性劑造成的環境污染問題的修復和處理具有重要的實際意義。

1 實驗部分

1.1 實驗材料、儀器及設備

1.1.1 實驗材料 Triton X-100非離子表面活性劑，福州飛凈生物科技有限公司；六水硝酸鈷、硫氰酸銨，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英國OXOID公司；核酸提取純化試劑盒，江蘇達伯藥業有限公司；硫氰酸鈷銨溶 液、三 氯 甲 烷、NaCl、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、FeSO4·7H2O、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 實驗儀器及設備 AR124CN電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；XL30 ESEM-FEG掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；SHP-1500生化培養箱、TSQ-280恒溫培養振蕩器，上海精宏實驗設備有限公司；Mikro 200R高速冷凍離心機，德國Hettich公司；Model 680酶標儀，美國Bio-Rad公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；HZQ-QX全溫振蕩器，哈爾濱東聯電子技術開發公司。

1.2 培養基的制備

MSM培養基：向500 mL燒杯中加入（NH4）2SO4（2.00 g）、MgSO4·7H2O（0.20 g）、CaCl2·2H2O（0.01 g）、FeSO4·7H2O（0.001 g）、Na2HPO4·12H2O（1.50 g）、KH2PO4（1.50 g）并混合，加適量去離子水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1 000 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度，置1 000 mL肖特瓶中保存。

富集培養基：在MSM培養基中加入質量分數為0.5%的酵母提取物，用玻璃棒攪拌促溶。

LB培養基：向500 mL燒杯中加入蛋白胨（10.00 g）、酵母提取物（5.00 g）、NaCl（5.00 g）并混合，加適量去離子水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1 000 mL容量瓶中并用去離子水定容至刻度（現用現配）。

1.3 菌株的分離與篩選

取適量某化工廠污水處理車間的活性污泥，接入100.00 mL富集培養基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養4 d后，取1 mL菌液再次加入100.00 mL富集培養基中，在30℃、150 r/min的條件下再次振蕩培養4 d，重復3次。

將上述經過多次富集培養的菌液適當稀釋后，接種于以Triton X-100為唯一碳源的MSM平板上，涂布均勻，在30℃的溫度下培養3～4 d。選取生長狀況較好的單菌落再次接種于Triton X-100/MSM平板進行復篩，劃線培養。

觀察復篩平板上菌落的顏色和形狀等特征，選取生長狀況良好的單菌落繼續于平板上劃線培養。經過多次培養后，根據菌落顏色和形狀等特征確定純培養菌株。

1.4 菌株的形態特征觀察

將純培養菌株在LB培養基平板上劃線培養（30℃）2 d后，使用掃描電鏡觀察菌體形態。

1.5 菌株的16S r DNA鑒定

使用16S rDNA測序對菌株進行鑒定[10]。16S rDNA擴增引物為通用引物：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（TACGGTTACCTTACGACTT）。將聚合酶鏈式反應（PCR）產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，在NCBI數據庫中進行比對分析，利用MEGA5軟件構建系統發育樹。

1.6 降解條件的考察

1.6.1 培養溫度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%（菌株ISB5與培養基的體積比，下同）的接種量接種于含Triton X-100（質量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養基中，在不同培養溫度、150 r/min下振蕩培養48 h，在12 000 r/min的條件下對培養物離心15 min后，取上清液測定Triton X-100的質量濃度。

1.6.2 振蕩速率對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%的接種量接種于含Triton X-100（質量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養基中，在不同振蕩速率、30℃的溫度下振蕩培養48 h后，測定培養物上清液中Triton X-100的質量濃度。

1.6.3 裝液體積（裝液量，下同）對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%的接種量接種于含Triton X-100（質量濃度為2 g/L）的不同體積的MSM培養基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養48 h后，測定培養物上清液中Triton X-100的質量濃度。

1.6.4 培養時間對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌株ISB5按1.00%的接種量接種于含Triton X-100（質量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養不同時間后，測定培養物上清液Triton X-100的質量濃度。

1.6.5培養基Triton X-100初始質量濃度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 將菌 株ISB5按1.00%的接種量接種于含不同質量濃度Triton X-100的100.00 mL MSM培 養 基 中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養48 h后，測定培養物上清液中Triton X-100的質量濃度。

1.6.6 接種量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響將菌株ISB5按不同的接種量接種于含Triton X-100（質量濃度為2 g/L）的100.00 mL MSM培養基中，在30℃、150 r/min的條件下振蕩培養48 h后，測定培養物上清中Triton X-100的質量濃度。

1.7 非離子表面活性劑的測定方法

通過硫氰酸鈷法（CTAS法）[11]測定Triton X-100的質量濃度。1.00 mL上清液中加入1.25 mL硫氰酸鈷銨溶液和1.50 mL氯仿，充分混勻將硫氰酸鈷-乙氧基鈷絡合物萃取到氯仿層中，進一步離心分層后，使用酶標儀在630 nm下測量氯仿提取物的吸光度，根據標準曲線計算Triton X-100的質量濃度，并計算降解率。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選

經數次分離純化，得到了一株對Triton X-100具有降解能力的菌株，命名為ISB5。對菌株ISB5菌落的生長狀態進行觀察，發現菌落較小，呈淡黃色，中間微微隆起，黏滑透明。

2.2 菌株的掃描電鏡形態分析

菌株ISB5的掃描電鏡顯微照片如圖1所示。由圖1可以看出，菌株ISB5個體呈桿狀或略彎曲的桿狀，兩端尖銳，無芽孢，無莢膜，菌體尺寸為（1.3～2.1）μm×（0.38～0.52）μm。

圖1 菌株ISB5的掃描電鏡顯微照片

2.3 16S rDNA擴增結果

把菌株ISB5的16S rDNA序列上傳至GenBank數據庫中，登錄號為MW741885。根據菌株ISB5的系統發育進化樹（見圖2），結合細菌的形態特征，將菌株初步鑒定為Pseudomonassp.（假單胞菌屬）。

圖2 菌株ISB5的系統發育進化樹

2.4 降解條件的優化

2.4.1 培養溫度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 培養溫度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖3所示。由圖3可以看出，隨著培養溫度的升高，Triton X-100的降解率呈現先上升后下降的趨勢；當培養溫度為30℃時，Triton X-100的降解率最高；當培養溫度大于30℃時，Triton X-100降解率呈下降趨勢，尤其是當培養溫度達到35℃后，下降趨勢非常明顯；當降解溫度為45℃時，Triton X-100的降解率僅為10.6%，說明菌株ISB5不適應偏高溫的生長環境。

圖3 培養溫度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響

2.4.2 溶解氧含量對菌株降解Triton X-100的影響 溶解氧含量是影響需氧微生物生長的重要條件，搖床培養過程中影響溶解氧含量的主要因素有搖床振蕩速率（振蕩速率，下同）和裝液量。

（1）振蕩速率對菌株ISB5降解Triton X-100的影響。振蕩速率對菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖4所示。

圖4 振蕩速率對菌株ISB5降解Triton X-100的影響

由圖4可以看出，隨著振蕩速率的增加，Triton X-100降解率呈先上升后下降的趨勢；當振蕩速率為110～170 r/min時，Triton X-100的降解率較高；當振蕩速率大于170 r/min時，隨著振蕩速率的增加，Triton X-100的降解率反而下降。其原因是：雖然振蕩速率的增加有助于液體培養基內溶解氧含量升高，但液體培養基內的剪切應力也會變大，而菌株所能承受的剪切應力是有限的，當剪切應力高于菌株承受能力的上限時，會抑制菌株生長甚至破壞菌株，使菌株的降解能力降低[12]。綜合考慮，選取150 r/min作為最適振蕩速率。

（2）裝液量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響。裝液量是液體微生物培養的重要影響因素，通過調整裝液量可控制培養基中的溶解氧和氧氣的傳遞效率。裝液量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖5所示。由圖5可以看出，當裝液量為60.00～100.00 mL時，隨著裝液量的增加，Triton X-100的降解率呈增長趨勢；當裝液量為100.00 mL時，Triton X-100的降解率最高；繼續增加裝液量，Triton X-100的降解率不再提高。

圖5 裝液量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響

2.4.3 培養時間對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 適宜的培養時間可使微生物有效地利用培養基中的營養物質，發揮其降解作用。培養時間對菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖6所示。

圖6 培養時間對菌株ISB5降解Triton X-100的影響

由圖6可以看出，隨著培養時間的增加，Triton X-100的降解率呈上升趨勢；培養時間為0～12 h時，Triton X-100的降解速度增加緩慢，這與菌株ISB5在此階段處于生長延滯期有關，此時菌株ISB5需要適應高質量濃度Triton X-100的存在；此后，隨著培養時間的增加，Triton X-100的降解率明顯提高，在32 h時降解率達到最大。但是，培養時間為28～32 h時，Triton X-100的降解率效變化不大。因此，從經濟角度考慮，選擇28 h為最適培養時間。

2.4.4 培養基Triton X-100初始質量濃度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 培養基Triton X-100初始質量濃度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖7所示。

圖7 培養基Triton X-100初始質量濃度對菌株ISB5降解Triton X-100的影響

由圖7可知，當Triton X-100初始質量濃度為1～4 g/L時，降解率呈現增長趨勢；當Triton X-100初始質量濃度為4 g/L時，Triton X-100的降解率最高，降解率達到93.0%；當Triton X-100初始質量濃度大于4 g/L時，Triton X-100的降解率隨著Triton X-100初始質量濃度的增加而降低，這可能是高質量濃度Triton X-100在一定程度上抑制菌體生長有關。2.4.5接種量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響 接種量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響如圖8所示。由圖8可以看出，當接種量小于1.00%時，Triton X-100的降解率隨著接種量的增加呈上升趨勢；當接種量大于1.00%時，菌株ISB5的降解率并無明顯的增加。

圖8 接種量對菌株ISB5降解Triton X-100的影響

3 結論

從某化工廠污水處理車間好氧曝氣池的活性污泥中篩選了一株對Triton X-100具有降解能力的菌株，對菌株ISB5的16S rDNA進行了測序和比對分析，將菌株ISB5鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonassp.）。對菌株ISB5降解Triton X-100的條件進行了考察，確定了菌株ISB5的適宜降解條件：培養溫度為30℃，培養基Triton X-100的初始質量濃度為4 g/L，培養時間為28 h，搖床的振蕩速率為150 r/min，裝液量為100.00 mL，接種量為1.00%。在此條件下，菌株ISB5對TritonX-100的降解率可達93.0%以上。