基于ZnSe-碳量子點熒光共振能量轉移體系檢測鹽酸強力霉素

劉長青， 廖楚健， 周素蓮， 易忠勝， 陶慧林

(1.青海省有色第一地質勘察院，青海西寧 810006；2.桂林市恭城瑤族自治縣婦幼保健院，廣西桂林 542500；3.桂林理工大學南寧分校，廣西南寧 530001；4.桂林理工大學化學與生物工程學院，廣西桂林 541004)

鹽酸強力霉素(Doxycycline hyclate,DOX)是四環素族半合成抗生素，主要用作抗革蘭氏陽性及陰性菌感染，不僅抗菌作用強，而且對四環素等耐藥的金黃色葡萄球菌有效，國內外應用較廣[1]。大量的鹽酸強力霉素排放到環境中，從而對生態系統和人體造成危害[2]。因此，有必要對DOX殘留進行監控。目前，文獻報道測定DOX的方法主要有比色法[3]、電化學法[1,4]、毛細管電泳法[5]、高效液相色譜法[6]、熒光光譜法[7,8]等。但這些方法成本較高，且需要復雜的樣品前處理和繁瑣的檢測步驟。因此，研究建立快速、準確的DOX分析技術，具有重要的科學意義。熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)是指一個熒光基團(供體，Donor)的發射光譜與另一個基團(受體，Acceptor)的吸收光譜有一定范圍的重疊，分子間的距離小于10 nm時，受體分子吸收來自供體分子能量的現象，是一種非輻射躍遷[9,10]。

近幾年來，具有優良光學特性量子點已逐步代替傳統染料用來建立熒光共振能量轉移體系。目前，在各類物質分析檢測上有很大的發展[11 - 13]。但是常用的半導體量子點多含有Cd、Pb、S等具有較強環境和生物毒性的元素，危害較大。雖然Zn也是一種重金屬，但其毒性遠遠小于Cd和Pb，且Zn和Se都是生物體必須的微量元素。而大量研究表明，CQDs生物、環境毒性很小。ZnSe量子點作為供體，CQDs作為受體建立的FRET體系用于檢測DOX的研究目前國內外尚未見報道。本文提出使用的ZnSe量子點為熒光供體，CQDs為受體構建FRET體系，在充分利用量子點所擁有的優勢的同時，又大大降低了量子點中毒性元素對環境造成的危害。最終基于該體系建立一個操作方便，設備簡單，靈敏度高且對環境友好的測定DOX的新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

RF-5301PC熒光光度計(日本島津)；TU-1901紫外可見分光光度計(北京儀器公司)；電子分析天平FA1244(中國江蘇儀器廠)；精密pH計(上海儀器廠)；JEM-1400型透射電子顯微鏡(TEM，日本電子)。

硒粉(AR，麥克林)；谷胱甘肽(BR，源葉生物)。三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH=7.2)；鹽酸強力霉素(DOX)標準溶液；實驗所用試劑均為分析純，所有用水均為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

1.2.1 ZnSe量子點的制備參照文獻方法[14]并作適當修改，首先稱取硒粉0.0078 g，硼氫化鈉0.0140 g加入細口瓶中，再加入300 μL二次水，冰浴40 min至硒粉完全溶解，得到無色透明的NaHSe溶液，備用。另取一個潔凈的三口燒瓶，加入0.0880 g乙酸鋅、0.1200 g谷胱甘肽和100 mL二次水，使用1 mol/L的NaOH調節至pH=11。在強磁力攪拌下，繼續通氮氣除氧20 min，隨后迅速加入備用的NaHSe溶液，繼續在氮氣的保護下，于95 ℃下連續攪拌回流1.5 h，即可獲得無色透明的ZnSe水溶性量子點溶液，并于4 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 CQDs的制備按文獻方法[15]并作適當修改，在反應釜的聚四氟乙烯內襯中依次加入檸檬酸鈉鹽0.20 g、碳酸氫銨1.50 g及10 mL蒸餾水，置于180 ℃鼓風干燥箱中反應4 h，冷卻至室溫。將反應后的溶液裝入100 mL的容量瓶中，稀釋至刻度，置于避光冰箱中保存備用。

1.2.3 DOX測定方法在一系列5 mL比色管中加入一定量的ZnSe、CQDs、DOX溶液，加入pH=7.2的Tris-HCl緩沖液1.50 mL，再用二次水定容至刻度，混勻，在25 ℃下放置反應5 min后，于λex=340 nm下測定相應熒光強度I。

2 結果與討論

2.1 ZnSe與CQDs的表征及量子產率

圖1(a)和1(b)分別為ZnSe量子點和CQDs的TEM圖，由圖1(a)和1(b)可知，所合成的兩種量子點呈準球形分布、分散性較好，粒子尺寸分布較為集中，粒徑大小主要集中在3 nm到5 nm之間。

圖1 ZnSe量子點(a)與CQDs(b)的TEM圖Fig.1 TEM images of ZnSe(a) and CQDs(b)

采用參比法測定供體與受體的熒光量子產率Φ[16]。計算公式如下：

(1)

式中，Φu、Φs為待測物和參比標準物的熒光量子產率；Fu、Fs為待測物和參比物的積分熒光強度；Au、As為待測物和參比標準物的吸光度。

本文采用硫酸奎寧溶液作為熒光參比物質。根據文獻報道[18]硫酸奎寧量子產率為0.55，據此測得ZnSe量子產率為0.21，CQDs量子產率為0.65。

2.2 ZnSe-CQDs能量轉移體系的構建

供體的發射光譜和受體吸收光譜有一定程度的重疊是其分子間發生能量轉移的條件之一[10,17]。因此對ZnSe量子點的熒光光譜和CQDs的吸收光譜進行分析(圖2)。由圖2(a)可知，ZnSe量子點的熒光峰在380 nm左右(曲線2)，CQDs的吸收峰在340 nm左右(曲線1)，兩者差為40 nm，有良好的光譜重疊，為發生能量轉移提供了前提條件。其中ZnSe量子點作為能量供體，而CQDs為能量受體。

為了保證能量轉移效果，采用340 nm作為激發波長，這樣CQDs能夠被充分激發，而ZnSe量子點被激發的熒光峰較弱，這樣就能很好地驗證能量轉移現象。結果如圖2(b)所示，體系中熒光供體ZnSe在380 nm處的熒光發生猝滅，將能量有效地轉移給受體CQDs，使CQDs在450 nm處的熒光顯著增強，說明在ZnSe-CQDs之間發生了明顯的熒光共振能量轉移。

為了進一步確定ZnSe-CQDs之間的FRET現象，測試了加入受體(CQDs)前后供體(ZnSe)熒光壽命的變化。如圖2(c)所示，供體的熒光壽命為6.65 ns，加入受體后其熒光壽命衰減為5.03 ns，加入受體后供體的熒光壽命發生了明顯變化。熒光壽命的測試結果再次證實了ZnSe-CQDs之間發生了熒光共振能量轉移。

圖2 (a) CQDs的吸收光譜(1)和ZnSe量子點的熒光光譜(2)；(b) ZnSe量子點(1),CQDs(2)和ZnSe-CQDs(3)的熒光發射光譜；(c)加入受體前(1)后(2)供體的熒光壽命衰減曲線。Fig.2 (a)Absorption spectrum of CQDs(1) and fluorescence spectrum of ZnSe(2);(b)Fluorescence spectra of ZnSe(1),CQDs(2) and the mixture of ZnSe-CQDs(3)；(c)Time-resolved decays of the donor before(1) and after(2) the addition of the acceptor.ρ(ZnSe)=15.00 μg/mL,ρ(CQDs)=1.50 μg /mL.

2.3 能量轉移相關參數的測定

根據F?rster非輻射能量轉移機制可知，影響能量轉移效率的主要因素是供體-受體之間的距離(r)與臨界能量轉移距離(R0)。供體與受體之間能量轉移滿足下面關系[18]：

(2)

(3)

(4)

式中K2為偶極空間取向因子(K2=2/3)，N為水的折射率(N=1.33)，Φ為供體的熒光量子產率(Φ=0.51)，J為供體的熒光發射光譜與受體的吸收光譜之間的光譜重疊積分。本實驗計算得到R0=2.54 nm，r=2.79 nm，J=4.3×10-15J/(cm3·L·moL-1)，說明ZnSe與CQDs能很好地結合，E=0.36，說明該體系具有較高的熒光共振能量轉移效率。

2.4 DOX對ZnSe-CQDs體系的熒光猝滅作用

圖3展示了ZnSe-CQDs體系對DOX的檢測原理。由圖3可知，DOX對ZnSe和CQDs均有猝滅。ZnSe與CQDs間的FRET現象導致ZnSe的熒光降低，CQDs的熒光增強，而DOX的加入則使得體系的熒光發生有效猝滅，根據兩個熒光團之間的熒光猝滅比率(I380/I450)與DOX濃度間的線性關系可實現DOX的檢測。

分別考察了DOX對ZnSe、CQDs、ZnSe-CQDs體系熒光強度的影響。ZnSe、CQDs、ZnSe-CQDs對DOX的響應范圍分別為0.025～3.20 μg/mL、0.20～12.80 μg/mL、和0.025～12.80 μg/mL。當DOX的濃度為0.80 μg/mL時，ZnSe的熒光被猝滅了60%左右，CQDs的熒光被猝滅了30%，而ZnSe-CQDs體系中ZnSe和CQDs的熒光分別被猝滅了80%和40%左右。實驗結果表明，FRET的熒光放大作用賦予了體系更高的靈敏度和更寬的線性范圍。此外，FRET體系的構建成功引入了兩個熒光團，為比率型熒光傳感器的構建提供了良好的前提條件。而比率型熒光傳感器具有自我校正功能，可以提高方法的準確度[19]。

為獲得最佳的實驗效果，考察了不同溫度、pH值、緩沖溶液以及表面活性劑對ZnSe-CQDs體系的影響。結果表明，在25 ℃下，pH為7.2的Tris-HCl緩沖溶液中DOX對ZnSe-CQDs熒光猝滅效果最佳。此時，5 min內DOX與ZnSe-CQDs即可反應完全，而且60 min內基本穩定。

圖3 ZnSe-CQDs體系對DOX的檢測原理Fig.3 Schemeatic display of the DOX detection via ZnSe-CQDs system

2.5 ZnSe-CQDs體系對DOX的檢測機理

采用Stern-Volmer方程考察了DOX對ZnSe-CQDs體系的熒光猝滅機理。一般而言，猝滅劑對熒光團的猝滅行為可分為靜態猝滅和動態猝滅[20]。靜態猝滅為猝滅劑和熒光團作用形成新的絡合物導致熒光猝滅，其猝滅常數(Ksv)隨著溫度的升高而降低；動態猝滅為猝滅劑和熒光團相互碰撞而導致熒光猝滅，其Ksv隨著溫度的升高而升高?？疾炝?88 K、298 K、308 K時DOX對ZnSe-CQDs體系中ZnSe和CQDs的熒光猝滅情況，結果如圖4(a)、圖4(b)所示。根據圖4(a)，288 K、298 K、308 K時DOX對ZnSe的Ksv分別為：2.1×107、1.9×107、1.6×107L/mol；而根據圖4(b)，在這三個溫度下DOX對CQDs的Ksv分別為：5.1×107、4.5×107、3.9×107L/mol?？梢?，DOX對ZnSe和CQDs的猝滅的Ksv都是隨著溫度的升高而降低，屬于靜態猝滅。因此，DOX對ZnSe-CQDs的熒光猝滅可歸屬為DOX與ZnSe、CQDs上的羥基、羧基等官能團發生反應，生成無熒光的基態化合物而導致體系的熒光猝滅。

圖4 不同溫度下DOX對ZnSe(a)和CQDs(b)的Stern-Volmer猝滅曲線Fig.4 Stern-volmer curves of DOX to ZnSe(a) and CQDs(b) under different temperatures c(DOX):0.00,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80 μmol/L;ρ(ZnSe)=20.00 μg/mL,ρ(CQDs)=2.00 μg /mL.

2.6 干擾實驗

2.7 工作曲線

圖5 工作曲線Fig.5 Calibration curveρ(ZnSe)=20 μg/mL,ρ(CQDs)=2.0 μg/mL,ρ(DOX):0.00,0.025,0.050,0.10,0.20,0.40,0.80,1.60,3.20,6.40,10.00 μg/mL.

在最佳實驗條件下，以FRET體系中450 nm處CQDs熒光團的熒光強度(I450)與380 nm處ZnSe熒光團的熒光強度(I380)比值(I450/I380)為Y軸，以DOX濃度為X軸，繪制工作曲線，結果如圖5所示。實驗結果表明，DOX濃度在0.025 μg/mL～10.00 μg/mL范圍內，I450/I380值與濃度呈良好的線性關系，線性回歸方程為I450/I380=3.68ρ+2.88，線性相關系數為r=0.9987，用3σ/k計算該方法的檢出限為7.51 ng/mL(n=11)。將本方法的線性范圍、檢出限與已發表的其他方法對比如表1所示。陶慧林等人[7]基于甲基紅和CdTe量子點之間的FRET現象建立了DOX的檢測方法，取得了良好的檢測效果。但是體系涉及到的甲基紅和CdTe都具有環境毒性，且該體系只是基于單一的熒光信號識別DOX，容易受環境的影響。而與甲基紅、CdTe相比，本研究涉及的CQDs和ZnSe更加綠色環保，采用雙熒光信號識別DOX，建立比率型熒光探針檢測DOX方法，可靠性更好，準確度更高。

表1 本方法與其他不同檢測方法在DOX分析中的性能對比

2.8 實際樣品檢測

采取健康新鮮尿液約20 mL于小燒杯中，靜置0.5 h后，取上清液5.00 mL裝入離心分離試管中，離心分離0.5 h，按實驗方法測定DOX的含量。結果如表2所示，方法的回收率在98.00%～106.3%之間。RSD≤6.1%(n=6)。表明所建立方法具有較高的準確度與精密度，可用于實際樣品分析。

表2 尿液中DOX的測定與加標回收實驗結果

3 結論

本文以ZnSe量子點為能量供體，CQDs為能量受體構建對生態環境綠色友好的ZnSe-CQDs熒光共振能量轉移體系，通過系列優化實驗后建立測定鹽酸強力霉素的新方法。在最佳條件下，方法的線性范圍為0.025～10.00 μg/mL，檢出限為7.51 ng/mL。將建立的新方法用于實際樣品測定時，回收率為98.00%～106.3%。方法線性范圍寬、靈敏度高、準確度好，具有潛在的應用價值。