柱前熒光衍生-離子液體微萃取-高效液相色譜法測定發酵食品中生物胺

李 宏， 史 巧， 王馨蕊， 陳駿飛， 肖飛健， 楊亞玲*

(1.云南省農業科學院農產品加工研究所，云南昆明 650033；2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650500)

生物胺(Biogenic amines，BAs)是一類低分子量、具有生物活性的有機堿，主要由醛、酮類物質在轉氨酶的作用下形成，或者游離氨基酸在微生物的脫羧作用下產生，常見的生物胺包括酪胺、組胺、腐胺、尸胺、色胺、苯乙胺、精胺和亞精胺等[1,2]。生物胺廣泛存在于食品中，尤其是釀造醬油、植物酵素、酒類等發酵食品中。攝入過量的生物胺，會對人體健康造成不良影響[3,4]，目前生物胺測定方法有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)、薄層色譜法(TLC)等[5 - 8]。高效液相色譜-串聯質譜法具有檢測靈敏度高、分析速度快等優點，但對儀器和技術要求高。由于生物胺類具有熱不穩定性，氣相色譜法和氣相色譜-串聯質譜法的應用也受到限制，因此高效液相色譜法是檢測生物胺含量的主要手段。多數生物胺除組胺之外無發光基團和熒光反應，需要對其進行衍生化處理，才能在色譜儀上進行檢測，常用的衍生試劑有丹磺酰氯、苯甲酰氯、鄰苯二甲醛等，其中丹磺酰氯(Dns-Cl)是生物胺檢測中最常用的衍生試劑，所得衍生物性質穩定且保存時間長，但其衍生過程繁瑣復雜，且耗時較長，不利于樣品的快速測定[9 - 13]。熒光胺能與化合物中的芳伯胺基生成高度熒光衍生物，且反應條件簡單，反應迅速。Akiko K等人在研究中采用熒光胺對生物胺進行衍生，然后利用液相色譜進行分離檢測，為本研究提供了較好的參考價值[14,15]。

食品樣品中生物胺的測定需要進行樣品制備，以除去樣品基質的干擾，并在HPLC分析前對分析物進行預濃縮[16]，液液萃取(LLE)[17]和液相微萃取(LPME)[18]是樣品前處理最常用的方法。分散液液微萃取是一種集采樣、萃取和濃縮于一體的樣品前處理技術，具有操作快速、所需儀器簡單、萃取費用低、對環境友好等優點。離子液體作為一種新型的極性溶劑，幾乎不需要較高的萃取溫度，并且具有不可燃性、非揮發性、良好的化學穩定性和熱穩定性，且離子液體可循環利用，對環境友好，故稱之為“綠色”化學溶劑，可以用來代替傳統的易揮發有毒溶劑，在食品樣品前處理及分析中備受關注[19,20]。

本研究報道了一種柱前熒光衍生-離子液體液液微萃取(IL-DLLME)結合HPLC測定發酵食品中生物胺的新方法。生物胺與熒光胺反應形成具有強烈熒光的衍生物(圖1)，以乙腈-甲醇-乙酸緩沖液作為流動相，并且以疏水性1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為萃取劑，1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽作為分散劑，進行生物胺的熒光胺衍生物萃取，由于衍生物與萃取劑良好的極性匹配性，可以達到較好的萃取效果，不僅降低基質的干擾，還可以提高檢測靈敏度，可用于發酵食品中生物胺的測定。

圖1 IL-DLLME-HPLC測定生物胺示意圖Fig.1 Schematic illustration of IL-DLLME-HPLC detection of BAs

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀，附熒光檢測器(美國，Agilent Technologies)，帶C18反相分析柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)；XW-800快速混勻器(上海汗諾儀器有限公司)；HC-3018R型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；pHS-3B精密酸度計(德國賽多利)；78-1型磁力加熱攪拌器(上海南匯電訊器材廠)；AB204-S電子分析天平(梅特勒-托利多)。

組胺、尸胺、腐胺鹽酸鹽(國家有色金屬及電子材料分析測試中心)；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([C8MIm][PF6]，上海國藥)；1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([C4MIm]BF4，上海國藥)；熒光胺(西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司)。所用試劑均為分析純，實驗用水均為去離子水(18.25 MΩ·cm)。

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1.2 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；熒光檢測波長：激發波長388 nm，發射波長490 nm；進樣量：20 μL；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min。流動相A：乙腈-甲醇(體積比為1∶1)；流動相B：HAc-NaAc緩沖溶液；梯度洗脫：0～16 min，30%～60%A；16.00～16.10 min，60%～90%A；16.10～22.00 min，90%A；22.00～22.10 min，90%～30%A；22.10～25.00 min，30%A。

1.3 衍生化方法

液相小瓶中依次加入200 μL生物胺混合標準溶液(或實際樣品提取液)、200 μL 3.0 mol/L NaAc及100 μL 0.2%熒光胺丙酮溶液，渦旋混勻30 s，暗處衍生20 min，衍生后體系由無色變為黃色，且帶有強烈的黃色熒光，衍生化反應如下：

1.4 IL-DLLME方法

將衍生溶液用去離子水定容到10 mL，快速注入150 μL [C8MIM]PF6和300 μL[C6MIM]BF4的混合液，旋渦混合1 min，此時管內形成黃白色乳濁液，以8 000 r/min離心5 min，管內溶液分層，離子液體沉積到下層，且呈黃色。用注射器針尖取出黃色層溶液，用乙腈定容至1 mL，過0.22 μm濾膜后，取20 μL供HPLC分析。其測定示意圖如圖1所示。

1.5 樣品前處理方法

稱取泡小米辣、榨菜和醬腌菜經勻漿處理混勻樣品1.00 g于15 mL離心管中，加入5 mL HClO4，于30 ℃水浴溫度下超聲提取30 min，過濾不溶物，取濾液用Na2CO3溶液調節pH至中性，用去離子水定容后待衍生化。

2 結果與討論

2.1 液液微萃取條件優化

2.1.1 萃取劑及分散劑的選擇對于生物胺的液液微萃取研究不多，有研究采用低共熔溶劑液液微萃取[21]，主要原因是生物胺是極性分子，在水中溶解度大，不能使用常規分散液液微萃取的萃取劑，如三氯甲烷、四氯化碳、氯苯、二硫化碳等進行。將生物胺進行熒光衍生后，其衍生物的極性減小，研究用無毒疏水性的離子液體作為萃取劑，考察了[C4MIM]PF6、[C5MIM]PF6、[C6MIM]PF6、[C7MIM]PF6及[C8MIM]PF6等5種離子液體。采用親水性離子液體作為分散劑，考察了[C4MIM]BF4及[C6MIM]BF4兩種離子液體對萃取效率的影響，如圖2。[C4MIM]PF6在水中有一定的溶解度，當[C8MIM]PF6與[C6MIM]BF4組合后，既保證了極性的匹配，又有合適的粘度。實驗中選擇此組合為萃取劑及分散劑，并同時考察了其用量(圖3)。實驗結果表明，當萃取劑體積小于150 μL時，萃取劑體積不足會導致萃取不完全；當萃取劑用量大于150 μL，萃取效率變化不明顯，遵循環保經濟的原則，選擇萃取劑用量為150 μL。當分散劑體積小于300 μL時，隨著用量增加分散劑能使萃取劑與樣品溶液接觸幾率增加，萃取效率不斷增強；當分散劑體積大于300 μL時，萃取效率反而降低，可能是因為分散劑用量過多稀釋樣品溶液，從而間接影響了萃取效率，因此選用萃取劑體積為150 μL，分散劑體積為300 μL。

圖2 萃取劑種類的選擇Fig.2 The effect of different extractant type

圖3 萃取劑用量(A)和分散劑用量(B)對萃取效率的影響Fig.3 Effect of extractant dosage(A) and dispersant dosage(B) on extraction efficiency

2.1.2 pH與溫度的影響大多數IL-DLLME方法是在中性條件下進行的，但[C8MIM]PF6在中性條件下，萃取率較低。實驗在pH 2.2～10范圍內考察了pH對萃取效率的影響。結果如圖4A，在pH=3時，萃取率較大，而pH在4～10時，萃取率逐漸減小，可能高pH條件下會對衍生物的穩定性產生影響，導致萃取回收率降低，故實驗選擇pH=3條件下進行反應。

此外，實驗還研究了溫度對萃取結果的影響,結果如圖4B所示，在室溫25 ℃下萃取率最高，因此本實驗選擇室溫25 ℃下萃取。

圖4 不同pH值(A)和溫度(B)對萃取率的影響Fig.4 Effect of different pH value(A) and temperature(B) on the extraction efficiency

2.1.3 鹽效應由于鹽能夠改變溶液的離子強度，在IL-DLLME中加入一定濃度的NaCl溶液，研究發現鹽濃度對萃取體系回收率影響不大。

2.2 方法分析性能

圖5 標準樣品的IL-DLLME-HPLC-FLD色譜圖Fig.5 Chromatograms of BAs with the pre-column fluorescent derivatization and DLLME

2.2.1 線性回歸方程、檢出限與定量限分別取生物胺(組胺、腐胺、尸胺)混合標準使用液0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mL，按照衍生化方法進行處理后，分別取各濃度混合標準工作液20 μL進樣，加入離子液體進行萃取，萃取前后色譜圖如圖5。由圖5可見，經IL-DLLME處理后，檢測靈敏度得到較大提高。依據生物胺峰面積Y和生物胺含量X進行線性回歸，所得各生物胺衍生物的線性回歸方程、相關系數、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)見表1，線性相關系數均大于0.996，檢出限為0.39～0.91 mg/kg，定量限為1.52～5.36 mg/kg，具有靈敏度高的特點，能夠用于生物胺的靈敏檢測。

表1 3種生物胺衍生物的線性回歸方程、相關系數、檢出限、定量限

2.2.2 方法回收率和精密度及樣品分析在優化后的提取條件下，將所建立的方法用于腌菜、榨菜、小米辣中的生物胺分析，結果在3種樣品中均檢出生物胺(表2)。為評價方法的準確度和適用性，設置添加濃度為5、25、50 mg/kg的3種生物胺，平行測定3次，計算其回收率。由表3可知，3種生物胺在腌菜、榨菜和小米辣中的回收率為81.0%～108.7%，表明該方法具有良好的準確度和適用性。3種生物胺的相對標準偏差均在1.7%到5.9%之間，表明該方法具有良好的精密度。

表2 腌制品中生物胺含量的測定結果(n=6)

表3 腌制品中生物胺含量加標回收率和相對標準偏差(RSD)

3 結論

建立了發酵食品中3種生物胺的測定方法，對提取液中的生物胺進行衍生化處理后，采用離子液體作為萃取劑和分散劑對衍生產物進行萃取，結果表明，樣品中的生物胺經過衍生萃取進行富集后，降低了檢測的檢出限。該方法具有簡便、快速和靈敏度高等優勢，且具有良好的適用性。