化痰通絡方對腦梗死大鼠半暗帶腦血管內皮細胞及血腦屏障的影響

徐家淳，孫偉明，王 凱，趙志恒，周 震

（天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250）

血腦屏障（BBB）是腦內重要的結構和功能單元，可維持組織穩態，調節腦內物質交換的平衡，而腦血管內皮細胞（BVECs）是構成BBB的基本單元。腦梗死發生后，BVECs受損、基底膜成分降解均可破壞BBB，使其通透性增加，引發一系列炎性反應，加重腦梗死［1-2］。因此，保護BVECs、促進BBB修復，對腦梗死的治療具有重要意義。中醫藥治療腦梗死方法多樣，本課題組臨床中一直采用化痰通絡方治療腦梗死患者，療效顯著［3-4］。為揭示化痰通絡方的療效機制，本研究采用光鏡、透射電鏡、伊文思藍（EB）染色觀察其對大腦中動脈栓塞（MCAO）大鼠BVECs形態和BBB的影響，為臨床應用該方提供實驗依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠81只，體質量240～260 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001。大鼠飼養于放射醫學研究所實驗動物中心，12 h光照/黑暗交替，室溫23～25℃，相對濕度50%～60%。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、中藥組，每組27只。造模前適應性喂養1周，食水自由。

1.2 主要試劑與儀器

蘇木素伊紅試劑盒（索萊寶，G1120），戊二醛（上海士鋒生物科技，R0652），EB溶液（上海源葉生物，S19046-5 g），透射電子顯微鏡（TEM，日立，HT7800），超薄切片機（Leica，EM UC7），石蠟切片機（Leica，RM2125RTS），光學顯微鏡（Leica，DM6MLIBS）。

2 方法

2.1 中藥制備

化痰通絡方由天麻10 g、半夏10 g、丹參30 g、膽南星5 g、川芎10 g、地龍10 g、酒大黃5 g組成。將5劑中藥加水濃煎500 mL，濃縮后生藥濃度0.8 g/mL。由天津中醫藥大學第二附屬醫院制劑中心制備，4℃保存。

2.2 動物造模

中藥組及模型組均參照Zea Longa線栓法［5］，制備MCAO模型：①大鼠固定、備皮、消毒；②剪開頸部皮膚，撕開頸部淺筋膜，鈍性分離，暴露左側頸總動脈和迷走神經；③分離左側頸外動脈和頸內動脈；④夾閉頸內動脈，結扎頸總和頸外動脈近心端；⑤插栓至頸總動脈分叉處18 mm左右，固定線栓；⑥清理、縫合并消毒手術創口。假手術組大鼠僅暴露并分離頸總、頸內和頸外動脈，不進栓。所有大鼠術前禁食24 h。

2.3 灌胃給藥

造模成功后，參照《藥理實驗方法學》［6］中“人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表”，按7.2 g/kg生藥濃度，中藥組大鼠每日予9 mL/kg化痰通絡方灌胃1次，假手術組和模型組大鼠每日予同體積蒸餾水灌胃1次。

2.4 觀察指標

各組大鼠分別于實驗后1 d、3 d、7 d采用相應方法取材。

2.4.1 光鏡觀察半暗帶BVECs微觀結構

每組于每個時間點隨機取3只大鼠，在相應時間點按照下列步驟灌注取材：麻醉→分離并夾閉腹主動脈→開胸暴露心臟→生理鹽水沖洗→沖至右心耳切口處流出澄明色液體，肝臟變白→推入100 mL 4%多聚甲醛→斷頭取腦→放入盛有4%多聚甲醛的小瓶中→染色切片→拍照觀察。

2.4.2 TEM觀察半暗帶BVECs超微結構

每組于每個時間點隨機取3只大鼠，在相應時間點按照下列步驟灌注取材：麻醉→分離并夾閉腹主動脈→開胸暴露心臟→生理鹽水沖洗→沖至右心耳切口處流出澄明色液體，肝臟變白→緩慢推入戊二醛電鏡固定液灌注→斷頭取腦→冰上將半暗帶組織切成1 mm3小塊（半暗帶的確定參照Ashwal方法［7］）→戊二醛電鏡固定液中固定→染色切片→TEM觀察照相。

2.4.3 EB染色檢測BBB通透性

每組于每個時間點隨機取3只大鼠，在相應時間點接受尾靜脈注射EB，灌注取全腦，以滲出的EB溶液含量檢測BBB通透性。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 各組大鼠不同時間點半暗帶BVECs微觀結構比較

假手術組各個時點BVECs呈梭形，形態飽滿，胞質粉染，核仁明顯，細胞間連接緊密，呈疊瓦狀分布于血管壁。模型組大鼠實驗后1 d時BVECs脫落，聚集于管腔中央，胞體腫脹，胞質少而淡，核腫脹，緊密連接消失；實驗后3 d時BVECs分布不均勻，部分緊密連接，少見梭狀細胞，胞質粉染，核形態各異；實驗后7 d時BVECs數量減少，連接較緊密，稍向管腔突出，胞質淡染，核仁不明顯。中藥組大鼠實驗后1 d時，BVECs形態結構與模型組大致相同；實驗后3 d時BVECs近似梭形，胞質淡染，可見空泡，部分核腫脹，表面光滑，細胞間連接緊密成完整的帶，突入管腔；實驗后7 d時BVECs呈梭形，胞質呈淡染，核漿比例較大，核深染，形態欠均，連接緊密。見圖1。

圖1 各組大鼠腦半暗帶血管內皮細胞微觀結構（×400）

3.2 各組大鼠不同時間點半暗帶BVECs超微結構比較

實驗后1 d時，假手術組BVECs核大、核膜完整，染色質密度均勻，核仁明顯；粗面內質網連續，游離核糖體分布均勻；線粒體完整，可見清晰的雙層膜結構與嵴。模型組大鼠BVECs輕度腫脹，核不規則增大；粗面內質網斷裂，游離核糖體明顯減少；部分線粒體明顯空化，僅留雙層膜。中藥組BVECs形態、細胞核、粗面內質網、線粒體基本與模型組相同。見圖2。

圖2 實驗后1 d各組大鼠腦半暗帶血管內皮細胞超微結構

實驗后3 d時假手術組BVECs形態、細胞核、內質網、線粒體與1 d時基本相同。模型組BVECs腫脹，核增大，部分核膜模糊，核仁不顯；粗面內質網斷裂、脫顆粒嚴重，核糖體呈不均勻分布、數量減少；線粒體嵴模糊伴嚴重的嵴斷裂、缺失。與模型組相比，中藥組BVECs腫脹減輕，核大，核膜完整，核仁明顯；粗面內質網、線粒體改變同模型組。見圖3。

圖3 實驗后3 d各組大鼠腦半暗帶血管內皮細胞超微結構

實驗后7 d時假手術組BVECs形態、細胞核、內質網、線粒體與1 d、3 d時相同。模型組BVECs仍腫脹，胞質減少，核大，部分核膜模糊、斷裂，核仁不顯；粗面內質網斷裂、脫顆粒嚴重，游離核糖體明顯減少；大多數線粒體僅留雙層膜。與模型組相比，中藥組BVECs形態恢復較好，基膜清晰，內膜完整；核大，核仁明顯；粗面內質網仍有脫顆粒，游離核糖體少；部分線粒體嵴和雙層膜結構恢復。見圖4。

圖4 實驗后7 d各組大鼠腦半暗帶血管內皮細胞超微結構

3.3 各組大鼠不同時間點BBB通透性比較

假手術組大鼠在各個時間點僅可見微量EB溶液；模型組EB溶液含量在各時間點均明顯高于假手術組，差異具有統計學意義（P＜0.05）；中藥組各時間點EB溶液含量均明顯低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間點伊文思藍（EB）溶液含量比較（±s，μg/g）

表1 各組大鼠不同時間點伊文思藍（EB）溶液含量比較（±s，μg/g）

注：與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別 實驗后1 d 實驗后3 d 實驗后7 d只數 只數 只數 EB假手術組 3 3 3 0.73±0.33模型組 3 3 3 9.35±0.44*中藥組 3 3 3 2.23±0.25#EB 0.96±0.17 14.06±0.01*5.37±0.19#EB 0.83±0.31 12.93±0.18*3.86±0.28#

4 討論

腦梗死發生后病灶由缺血中心區及其周圍的缺血半暗帶組成，拯救缺血半暗帶神經細胞是治療腦梗死的關鍵。眾多研究表明，BVECs和BBB在缺血半暗帶神經細胞的恢復中發揮著重要作用［8-9］。BBB是大腦微循環的重要結構基礎，不僅可維持腦組織穩態、調節腦內物質交換平衡、保護腦組織，還可以有效地調節腦血流，促進半暗帶血流恢復［10-11］。腦梗死發生后，BBB的完整性被破壞，通透性增加，水和一系列大分子物質通過開放的BBB進入細胞外間隙，加速腦水腫形成；此外，BBB開放時血流速度減慢、基底膜破壞等加速了神經細胞的破壞與功能喪失［12］。

BVECs及其緊密連接是構成BBB的基礎單位，也是BBB的重要結構與功能基礎，控制著BBB的完整性與物質交換；BVECs可合成并分泌一氧化氮（NO）、內皮素（ET）等活性物質［13］，可調節血管平滑肌的舒縮功能，以保持血管的通暢、維持血液循環［14］。BVECs損傷、脫落可破壞BBB的完整性，加重腦組織缺血缺氧［12］。因此，促進腦梗死后BVECs、BBB修復，可保護缺血半暗帶神經細胞，促進神經功能恢復?，F代研究圍繞促進腦梗死后BVECs的修復方面做了許多工作［15-16］，其機制與促進分泌細胞因 子［17-19］、血管內皮生長因子和胰島素樣生長因子，進而促進血管內皮細胞修復、生長有關［20-22］。

本研究結果發現，假手術組中基本無EB溶液滲出，表明假手術組大鼠BBB的完整性良好。而模型組在實驗后1 d時可見大量EB溶液滲出，表明腦梗死急性期BBB遭到嚴重破壞；但隨觀察時間延長，實驗后3 d和7 d模型組EB溶液滲出較1 d時減少，表明腦梗死后BBB呈現一定的自我修復能力。研究表明急性腦梗死后BVECs首先發生細胞腫脹、固縮、壞死、緊密連接消失［23］，本研究結果與這一現象基本一致，實驗后1 d時BVECs的改變以連續性消失、脫落、腫脹、基膜斷裂、細胞器丟失為主，實驗后3 d和7 d BVECs細胞腫脹減輕，細胞器成分恢復，表明在腦梗死發生后存在BVECs的損傷及死亡，但隨觀察時間的延長，BVECs呈現出一定的修復現象。與模型組相比，中藥組在實驗后7 d BVECs形態得到明顯改善，EB溶液滲出現象也明顯減少，表明化痰通絡方可促進BVECs及BBB修復。

中醫學將腦梗死歸屬于中風范疇，對其論治可追溯至《金匱要略》侯氏黑散、風引湯。該病急性期與風、火、痰、瘀等病因密切相關，根據“急則治其標”的原則，在急性期使用化痰瀉濁、祛瘀通絡的方藥切中病機?；低ńj法是國醫大師張伯禮院士在其主持的國家“十五”科技攻關課題“中風病急性期綜合治療方案研究”中提出的，經臨床驗證療效顯著。方中天麻甘、平，可息風止痙、祛風通絡；半夏辛、溫，膽南星辛、苦，共奏化痰息風之功；川芎與丹參活血行氣逐瘀；地龍息風通絡；酒大黃清熱祛瘀瀉濁。諸藥共用以祛風化痰、逐瘀通絡。前期臨床研究發現，該方可促進腦梗死急性期患者神經功能恢復，提高日常生活能力，提升生活質量［3-4］，其機制可能與調控內質網應激水平、保護神經細胞有關［24-25］。

本研究發現，經化痰通絡方干預后，BVECs形態和基膜完整性基本恢復，受損的細胞核及細胞器均有改善，尤其是實驗后7 d線粒體損害的嵴與雙層膜結構均有好轉。且經化痰通絡方干預后，通透性遭到破壞的BBB得到了一定程度的恢復，這與化痰通絡方對損壞的BVECs形態及細胞器的修復、保護作用具有一定關系。因此，化痰通絡方改善急性腦梗死后半暗帶BVECs損傷、促進BBB修復可能是該法促進腦梗死后神經功能恢復的起效機制之一。