金貝口服液制備過程中指標成分黃芪甲苷的傳遞研究

張愛均，嚴嘉偉，丁 琳，陶 凱，張良棕，孟兆青

（1.山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，山東 濟南 250100；2.山東省中醫藥治療呼吸系統疾病技術創新中心，山東 濟南 250100；

3

.山東中醫藥大學附屬醫院，山東 濟南 250014）

金貝口服液由黃芪、北沙參等12味中藥組成，具有益氣養陰、祛瘀化痰的作用，主要用于特發性肺纖維化屬氣陰兩虛兼痰瘀交阻證，癥見氣短、乏力、喘促、咳嗽、胸痛、紫紺等。該制劑來源于山東中醫藥大學附屬醫院陶凱主任醫師的經驗方，臨床以湯劑給藥效果明顯。黃芪為本制劑處方君藥，主要含有多糖、黃酮類化合物及三萜皂苷［1］，其中黃芪甲苷（黃芪皂苷Ⅳ）為黃芪的主要活性成分，具有抗炎、抗肝纖維化、抗氧化、抗哮喘、降血糖、免疫調節和心肌保護等多重功效［2］，是本制劑內控質量標準的指標成分。

本研究以金貝口服液君藥黃芪中黃芪甲苷為指標，對制備過程各工序中黃芪甲苷的傳遞情況進行考察，得到影響黃芪甲苷傳遞的主要工藝和因素，獲得了科學合理的制備工藝和控制參數，保證了金貝口服液質量的均一性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（Waters，e2695），超高效液相色譜儀（安捷倫，UHPLC-1290），電熱恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表，DFD-700），型號十萬分之一電子天平（Mettler-toledo公司，XS105），十功能自動煎藥機（北京東華原醫療設備有限公司，YJD20D-GL），旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿有限公，R-1020），循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司，SHB-Ⅲ），恒溫磁力攪拌器（德國IKA，RET basic），pH計［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，FiveEasy Plus］，灌裝機（山東青州市精誠醫藥裝備制造有限公司，ZG-30A），壓力蒸汽滅菌器（山東博科生物產業有限公司，BKQ-B100II）。

1.2 試藥

黃芪甲苷（中國食品藥品檢定研究院，批號110781-201717，含量96.9%），色譜乙腈（德國Merck公司，批號JA097830），色譜甲醇（德國OMNI公司，批號190150329M22），其他試劑均為分析純。金貝口服液為中試產品（批號1912001、1912002、1912003）。

2 方法

2.1 金貝口服液的制備流程圖及取樣點

見圖1。

圖1 金貝口服液制備流程

2.2 樣品的制備、色譜條件及黃芪甲苷含量測定方法學研究

2.2.1 樣品制備

對照品溶液的制備：稱取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解，配制成質量濃度為0.5612mg/mL的對照品溶液，備用。

黃芪甲苷含量測定供試品溶液的制備：精密量取各取樣點溶液（相當于成品20 mL，折合中藥飲片14.24 g，折合黃芪1.32 g），用水飽和正丁醇提取3次，每次30 mL，合并正丁醇提取液，用1%氫氧化鈉洗滌兩次，每次30 mL，棄去氫氧化鈉液，再用正丁醇飽和的水30 mL洗滌1次，棄去水液，正丁醇提取液蒸干，殘渣加甲醇溶解，定量轉移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，續濾液作為供試品溶液。

指紋圖譜研究供試品溶液的制備：精密量取金貝口服液20mL，置具塞錐形瓶中，精密加入50%色譜甲醇60mL，稱定質量，超聲（300W，40kHz）處理30min，放至室溫，補重，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

黃芪飲片供試品溶液的制備：參照《中國藥典》2020年版黃芪中供試品制備的方法［3］。

2.2.2 色譜條件及方法學研究

2.2.2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18（5μm，4.6mm×250mm）色譜柱，流動相為乙腈-水（34∶66），流速1.0 mL/min，柱溫25℃，進樣量10μL，蒸發光檢測器，氣體流速25 psi，漂移管溫度60℃，增益值2。

Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（2.1mm×150 mm，2.7μm）色譜柱，柱溫25℃；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫64 min，流速0.2 mL/min，進樣量1μL，檢測波長254 nm。見表1。

表1 金貝口服液制備指紋圖譜流動相線性梯度表

2.2.2.2 方法學考察

線性范圍考察：精密稱取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含0.968 50 mg、0.484 30 mg、0.193 70 mg、0.096 85 mg、0.038 74 mg、0.019 37 mg的對照品溶液，取10μL進樣，如法測定，以峰面積對數值對黃芪甲苷進樣量的對數值進行線性回歸。

專屬性試驗：按照處方的比例和制備工藝，制備不含黃芪的金貝口服液陰性對照樣品，再按供試品溶液的制法制成陰性對照。吸取供試品溶液、陰性對照溶液、黃芪甲苷對照品溶液和空白溶劑（甲醇），依法測定。

重復性試驗：精密量取已知含量的成品（批號1912001）6份，每份20 mL，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測定黃芪甲苷的含量，計算相對標準偏差（RSD）。

穩定性試驗：精密量取已知含量的成品（批號1912001）20 mL，按供試品溶液制備方法制備，分別于配制后0、3、6、8、16、20、24 h測定黃芪甲苷的含量，計算RSD。

準確度試驗：精密量取已知含量的成品（批號1912001）10 mL，按1∶1比例精密加入黃芪甲苷對照品，照供試品制備方法制成供試品溶液并測定黃芪甲苷的含量，以回收率計算黃芪甲苷平均回收率。

2.3 各取樣點樣品中黃芪甲苷含量測定

吸取各取樣點溶液，依照同供試品溶液制法配制供試品溶液，計算黃芪甲苷轉移率。

2.4 乙醇沉淀（醇沉）工藝的優化

醇沉時，加乙醇速度、攪拌速度、醇沉溫度對成分轉移率有較大影響，因此分別對各因素進行參數優化。

2.4.1 加乙醇速度和攪拌速度的優化

取同一批次金貝口服液濃縮液18份，分6組，每組3份平行樣品。1、2、3組控制加乙醇速度，分別為50 mL/s、150 mL/s、250 mL/s，攪拌速度300 r/min，醇沉溫度2℃，醇沉時間24 h；4、5、6組控制變量攪拌速度，分別設定為300 r/min、600 r/min、900 r/min，醇沉溫度2℃，醇沉時間24 h，加醇速度50 mL/s。如法取樣，測定黃芪甲苷的含量，計算轉移率。

2.4.2 醇沉溫度的優化

取同一批次金貝口服液濃縮液12份，分4組，每組平行3份，邊攪拌邊加入乙醇至醇濃度為65%，分別使藥液降至不同溫度（0℃、2℃、4℃、6℃），靜置24 h，濾過，得濾液。如法取樣，測定黃芪甲苷的含量，計算轉移率。

2.5 滅菌前pH值的優化

取9份同一批次金貝口服液水沉液，分成3組，每組平行3份，分別按處方量加入輔料后用8%氫氧化鈉水溶液調酸堿度，pH值分別調至5.70、6.00、6.70，分別灌裝，于105℃環境滅菌30 min。滅菌前后分別如法取樣測定，同時測定滅菌前后pH值變化。

2.6 滅菌溫度和滅菌時間的優化［4］

中藥制劑生產中滅菌條件選擇不僅需要考慮微生物殺滅效果，還需要從整體上考慮滅菌對化學成分的影響。取同一批次金貝口服液灌裝后滅菌前樣品9份（灌裝前pH值調至6.00），分別以不同條件進行滅菌操作。以黃芪甲苷轉移率、超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜、澄清度以及微生物限度為評價指標，考察不同滅菌條件對金貝口服液的指標成分轉移率、化學成分、微生物及澄清度的影響。

鑒于口服制劑工業生產中滅菌溫度一般選擇為115℃、110℃、105℃三個溫度點，滅菌時間一般為15 min、20 min、30 min，故本次研究共進行了三個溫度點不同滅菌時間的考察。

2.7 不同滅菌條件的優化

滅菌前后分別取一定體積的樣品（相當于成品20 mL，折合生藥材14.24 g，折合黃芪藥材1.32 g），按2.2.1項下樣品制備方法及2.2.2.1項下色譜條件分別進行黃芪甲苷含量測定，并計算滅菌后成品中黃芪甲苷相對于滅菌前配制液的轉移率。按2.2.1項下指紋圖譜樣品制備方法及2.2.2.1項下指紋圖譜色譜條件分別進行指紋圖譜測定。

3 結果

3.1 方法學考察

3.1.1 線性范圍考察

以所測得黃芪甲苷色譜峰面積對數值和黃芪甲苷進樣量的對數值進行線性回歸，計算得回歸方程Y=0.6324X-3.3055，相關系數r=0.999 9。結果見圖2。

圖2 金貝口服液黃芪甲苷含量標準曲線

3.1.2 專屬性試驗

空白溶劑和陰性對照溶液在黃芪甲苷色譜峰位置處未見吸收峰。結果見圖3。

圖3 黃芪甲苷含量檢測專屬性圖譜

3.1.3 重復性試驗

6份供試品中黃芪甲苷含量RSD為1.76%。結果見表2。

表2 不同供試品黃芪甲苷含量檢測重復性試驗結果

3.1.4 穩定性試驗

供試品溶液分別于配制后0、3、6、8、16、20、24 h黃芪甲苷含量RSD為2.59%。結果見表3。

表3 不同時間點黃芪甲苷含量檢測穩定性試驗結果

3.1.5 準確度試驗

供試品中黃芪甲苷平均回收率為92.59%。結果見表4。

表4 黃芪甲苷回收率測定結果

3.2 各取樣點樣品中黃芪甲苷含量測定

計算各取樣點溶液中黃芪甲苷的轉移率。結果見表5、表6、圖4。

圖4 金貝口服液制備過程中黃芪甲苷轉移率變化曲線

表5 各取樣點黃芪甲苷檢測結果

表6 黃芪甲苷轉移率計算結果

3.3 乙醇沉淀工藝的優化

3.3.1 加乙醇速度和攪拌速度的優化

各樣品溶液中黃芪甲苷的轉移率，見表7。

表7 不同加醇方式下金貝口服液醇沉液中黃芪甲苷的轉移率比較

3.3.2 醇沉溫度的優化

各樣品溶液中黃芪甲苷的轉移率，見表8。

表8 不同醇沉溫度下金貝口服液中黃芪甲苷轉移率比較

3.4 滅菌前pH值的優化

各樣品溶液pH值、黃芪甲苷含量及轉移率，見表9。

表9 不同配制液pH值下金貝口服液中黃芪甲苷轉移率比較

3.5 滅菌溫度和滅菌時間的優化

各供試品黃芪甲苷含量測定及轉移率見表10。指紋圖譜見圖5，相似度分析結果見表11。

表11 金貝口服液不同滅菌條件下黃芪甲苷含量的相似度分析

表10 不同滅菌條件下金貝口服液中黃芪甲苷轉移率比較

4 討論

本次研究對供試品溶液的制備及檢測方法進行了方法學考察，研究結果顯示，黃芪甲苷進樣量在0.1937～9.6850μg內具有良好的線性關系，專屬性、重復性良好，供試品溶液在24 h內穩定，方法準確。

醇沉工序相對前工序黃芪甲苷轉移率為78.34%～90.08%，平均轉移率為83.99%；滅菌工序相對前工序黃芪甲苷轉移率為75.61%～78.93%，平均轉移率為77.15%；其余工序黃芪甲苷相對前一工序轉移率均大于90%，說明本制劑制備中影響黃芪甲苷量質傳遞的關鍵工序是醇沉和滅菌工序，優化醇沉及滅菌參數是穩定黃芪甲苷轉移率的關鍵工序。

不同的加乙醇速度和攪拌速度均對醇沉工序相對上一工序黃芪甲苷轉移率具有顯著影響。研究結果顯示加乙醇速度50 mL/s、攪拌速度600 r/min時，可以達到較為理想的醇沉效果。不同醇沉溫度條件下，靜置24 h，黃芪甲苷轉移率在4℃、6℃條件下較0℃和2℃條件下稍低，考慮到產品質量、醇沉效果、能耗等因素，確定醇沉溫度控制在（2±1）℃。故金貝口服液醇沉工序參數是乙醇加速度50 mL/s、攪拌速度600 r/min、乙醇沉淀溫度（2±1）℃。

隨著配制液pH升高，黃芪甲苷轉移率逐漸升高；當pH上升至5.99后，黃芪甲苷轉移率基本平緩。黃芪皂苷主要有黃芪皂苷Ⅰ～Ⅶ、乙酰黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅰ～Ⅳ等，其中黃芪皂苷Ⅳ又稱為黃芪甲苷，隨著藥液pH升高，黃芪皂苷Ⅰ～Ⅱ等皂苷成分可發生酯水解反應轉化為黃芪甲苷［5-7］。故在配制液pH值調節過程中，可能存在部分黃芪皂苷Ⅰ及其衍生物轉化為黃芪甲苷，考慮到皂苷成分轉化和生產可操作性，建議金貝口服液配制液最佳pH范圍為6.00±0.05。黃芪甲苷轉移率研究結果顯示，不同滅菌條件對黃芪甲苷轉移率影響并不明顯，說明黃芪甲苷在一定溫度條件下具有一定的穩定性；指紋圖譜研究結果顯示，不同滅菌條件下的指紋圖譜無指紋峰丟失，與對照指紋圖譜相比，相似度均大于0.996，說明9個滅菌條件下樣品整體化學成分一致性均較好，且滅菌前后成分種類基本無變化，滅菌對金貝口服液整體化學成分影響并不顯著。因此從化學成分、滅菌效果以及澄清度等因素整體考慮，確定金貝口服液滅菌前配制液pH值為6.00±0.05、滅菌溫度為105℃、滅菌時間為30 min。

本研究證實了金貝口服液制備過程中黃芪甲苷含量變化呈整體下降趨勢，以黃芪甲苷在金貝口服液制備過程中的傳遞為依據，表明醇沉、滅菌工序是制備中的關鍵環節。

本研究對金貝口服液醇沉工序進行了參數優化，結果顯示溫度低時，黃芪甲苷和鞣質、蛋白質等雜質溶解度及轉移率降低，但雜質去除率較高；反之，除雜效果較差。研究過程發現醇沉靜置期間溫度越高，沉淀物越松軟，上清液越難以過濾，所得過濾液越少，黃芪甲苷轉移率越低。攪拌速度過快和快攪時間過長，形成的絮體細小，沉降或過濾困難，除增大絮體和藥液分離的難度以外，還會造成已經被絮凝劑高分子吸附的脫附，大絮體被強剪切力撕裂成小絮體，絮凝后藥液濁度上升，所以在保證絮凝高分子和藥液快速混合均勻的條件下，快攪速度盡量小，快攪時間盡量短［8］。另醇沉前浸膏的組成和性質也可能因原藥材產地、氣候、采集時間等差異而存在質量波動，關于這些潛在質控風險因素對醇沉效果的影響程度還有待一步研究。

本研究以黃芪甲苷轉移率、滅菌效果、指紋圖譜、澄清度等為考察指標對滅菌前配制液pH范圍、滅菌溫度、滅菌時間等進行了研究，結果表明配制液最適宜酸堿度是6.00±0.05，在該pH范圍內既可以保證黃芪甲苷轉移率，又可以滿足金貝口服液質量標準要求。通過對不同滅菌溫度和滅菌時間的考察，未發現二者對金貝口服液化學成分有明顯影響，但對澄清度和微生物限度有一定的影響：滅菌溫度越高，時間越長，澄清度越差，微生物限度恰與之相反。為保證制劑質量，應全面考慮滅菌溫度和時間參數，本制劑最適宜滅菌溫度為105℃，滅菌時間30 min。

中藥成分的復雜性決定了單味中藥材就是一個復方制劑，金貝口服液由12味中藥組成，其成分復雜性可想而知。本次研究是以主要有效成分黃芪甲苷為指標考察金貝口服液制備過程中成分的傳遞，從而對金貝口服液進行關鍵參數優化。雖然優化后的制備工藝可以保證黃芪甲苷有較為理想的轉移率，但并不能完全說明本次研究所優化參數為最佳參數，與藥效相關聯的、更深入的工藝優化研究與金貝口服液物質基礎及體內作用物質研究有待進一步開展。在新藥研究及產品全生命周期內均應持續進行關鍵工藝及關鍵參數的優化研究。