基于腸道菌群探究化鐵丸抗結腸癌作用機制

謝 輝，周紅光，李 黎，李沐涵，李文婷，周洪立，陳海彬，3

（1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院腫瘤研究所，江蘇 南京 210000；3.南京中醫藥大學科技處實驗動物中心，江蘇 南京 210000）

結腸癌在世界范圍內較為常見，在所有惡性腫瘤類型中男性和女性發病率分別排名第二和第三［1］，病死率排第二位［2］。人體腸道內微生物的種類與數量繁多，環境復雜，微生物群落結構或數量的改變，都會影響腸道生理功能［3］。人體腸道內約有100萬億種微生物，包括細菌、真菌、古菌、原生生物以及病毒。腸道微生物失衡會影響免疫系統、代謝產物以及信號通路之間的聯系，從而導致腸道腫瘤的發生和發展［4-6］。目前已經證實中醫藥在抑制結腸癌的發生中起重要作用，調節腸道微生物是治療結腸癌的新療法。如Zhang等［7］研究發現，蠶梅方可調節腸道微生物群中有益菌、有害菌的組成，減少小鼠結腸炎癥，從而抑制結腸癌發生；Lv等［8］發現葛根芩連湯通過重塑腸道微生物群和腫瘤微環境，增強程序性死亡受體-1（PD-1）抑制劑在結腸癌中的療效；Sun等［9］發現祛邪膠囊參與腸道菌群及T細胞功能調節，改善轉移性結腸癌患者臨床癥狀。中藥方劑化鐵丸出自《普濟方》，由威靈仙、楮實子組成，主治腹中痞積。已有研究表明，方中威靈仙可提高免疫力，楮實子可降低炎癥因子水平、改善腸屏障功能［10-12］?；F丸能否抑制結腸癌發展，其具體機制是什么，目前尚無明確動物實驗依據。本研究通過建立結腸癌HCT116移植性裸小鼠模型，分析經化鐵丸處理后各裸小鼠的菌群差異，從腸道菌群角度探討其治療結腸癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物

HCT116結腸癌細胞購于上海中喬新舟公司，樣本號20170303-06，細胞號對應號CCL-247。SPF級雄性BALB/c裸小鼠36只，5～6周齡，體質量（18.54±2.36）g，購自揚州大學比較醫學中心，許可證號SYXK（蘇）2017-0007，貨號202008557。飼養于南京中醫藥大學動物飼養中心，設置室溫為22～23℃，相對濕度為60%～70%，每日光照與黑夜各12 h交替。動物實驗由南京中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準號202008A009）。

1.2 藥物與試劑

化鐵丸由威靈仙15 g、楮實子15 g組成，藥材購自江蘇省百草堂（批號分別為191101、191120），由南京中醫藥大學藥學院王愛云教授鑒定均符合2015年版《中華人民共和國藥典》要求。細胞培養基（高糖，DMEM）購自Biological Industries公司（批號01-052-1ACS）；胎牛血清購自Biological Industries公司（批號04-001-1ACS）；無鈣離子磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 分組及造模

1.3.1 藥物制備

將化鐵丸整方藥材置于容器內加10倍體積水，浸泡2 h后大火煮開，再小火煮1 h，取濾液。藥渣加8倍體積水繼續煮1 h，取濾液。將兩次濾液混合均勻后濃縮成生藥量2 g/mL的藥液，儲存備用。

1.3.2 腫瘤細胞培養及結腸癌移植瘤模型的建立

結腸癌HCT116細胞培養于含10%胎牛血清DMEM的培養基中，于37℃恒溫培養箱中培養。當細胞培養至80%的對數生長期時，用含0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔1～2 d傳代1次。當細胞處于對數生長期時用PBS把細胞濃度調至每毫升2×107個，注射0.2 mL到裸小鼠右腋下，SPF條件下飼養8～10 d，右腋皮下有肉眼可見的米粒大小瘤塊為造模成功。

1.3.3 分組及給藥

剔除造模不成功的4只裸小鼠后，將造模成功的32只裸小鼠隨機分成對照組及化鐵丸低、中、高劑量組，每組8只。對照組予生理鹽水灌胃；按照成人和小鼠之間體表面積等效劑量換算公式將臨床成人的常規使用劑量換算成裸小鼠的等效劑量作為中劑量給藥量，即裸小鼠低劑量為1.82 g/（kg·d），中劑量為3.64 g/（kg·d），高劑量為14.56 g/（kg·d）灌胃，每日1次，每次每只0.2 mL，連續給藥21 d。

1.4 裸小鼠的一般狀態

每日觀測裸小鼠的精神狀況、活動、飲食飲水量；用藥組與對照組瘤體積開始有顯著性差異后，收集各組裸小鼠糞便，放入凍存管，-80℃冰箱中保存。

1.5 裸小鼠移植瘤體積及藥物抑瘤率

自首次給藥起，每隔3 d用游標卡尺測量裸小鼠移植瘤的長軸（a）和短軸（b），并根據公式V=1/2ab2計算瘤體體積。末次給藥24 h后處死所有裸小鼠，剝離瘤組織，稱量瘤重。統計各組抑瘤率（IR），IR=（1-用藥組瘤重/對照組瘤重）×100%。

1.6 生物信息學分析

將抑瘤率最高的給藥組與對照組裸小鼠糞便交由上海市凌恩生物科技有限公司進行16SrDNA測序，運用Illumina Nova Seq高通量測序平臺對各組細菌16SrRNA基因V3～V4區進行測序。使用QIIME程序對序列進行生物信息學分析，uParse軟件對有效數據在97%水平的操作分類單元（OTU）行聚類分析。根據OTU結果，以微生物多樣性分析比較組間菌群差異；根據LDA值分布柱狀圖和LEfSe多級物種差異，判別篩出對差異有影響的物種。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 化鐵丸對結腸癌HCT116裸小鼠移植瘤的抑制作用

2.1.1 各組裸小鼠生存狀態及體質量變化

給藥期間，各用藥組裸小鼠精神狀況良好，遇刺激反應靈敏，飲食飲水量與對照組無明顯差別。對照組裸小鼠體質量變化幅度小，化鐵丸低、中、高劑量組裸小鼠體質量升幅高于對照組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組裸小鼠體質量比較（±s，g）

表1 各組裸小鼠體質量比較（±s，g）

組別 只數 1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d對照組 8 18.20±0.48 18.50±0.52 18.60±0.62 18.60±0.71 19.20±0.70 19.80±0.74化鐵丸低劑量組 8 18.50±0.44 19.10±0.47 19.50±0.45 20.10±0.56 20.50±0.54 20.80±0.67化鐵丸中劑量組 8 18.20±0.56 19.50±0.65 20.20±0.67 20.60±0.68 20.80±0.70 21.20±0.74化鐵丸高劑量組 8 17.80±0.61 18.50±0.66 18.20±0.62 19.50±0.66 20.20±0.68 20.40±0.72

2.1.2 各組裸小鼠瘤體積變化

隨時間推移各組裸小鼠瘤體積呈增長趨勢。從第13天起，化鐵丸低、中、高劑量組與對照組比較，移植瘤體積生長較慢，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；第21天時，化鐵丸中劑量組腫瘤體積最小，對照組腫瘤體積最大，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表2、圖1。

圖1 給藥21 d后各組裸小鼠移植瘤離體圖

表2 各組裸小鼠移植瘤體積比較（±s，mm3）

表2 各組裸小鼠移植瘤體積比較（±s，mm3）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 只數 1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d對照組 8 143.6±8.9 352.6±34.6 652.3±40.2 878.1±52.1 1125.6±71.2 1425.6±92.5化鐵丸低劑量組 8 141.5±10.2 235.5±26.4 490.5±33.5 675.5±44.2* 894.1±64.5* 925.6±77.8*化鐵丸中劑量組 8 138.3±7.6 209.5±21.2 416.3±28.6 546.5±39.4** 757.6±48.7** 812.5±69.5**化鐵丸高劑量組 8 136.8±9.4 223.5±22.5 565.8±38.5 725.6±48.7* 856.9±59.6* 1025.6±80.3*

與對照組比較，各用藥組裸小鼠移植瘤瘤重顯著減輕，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；化鐵丸低、中、高劑量組的抑瘤率分別為36.0%、44.0%、32.1%，說明化鐵丸能夠抑制結腸癌增長且中劑量組效果最好。見表3。

表3 各組裸小鼠抑瘤率比較

2.2 化鐵丸中劑量組與對照組微生物變化

由于中劑量化鐵丸相當于臨床人體所使用劑量，且抑瘤效果最好，故選取化鐵丸中劑量組裸小鼠糞便微生物與對照組裸小鼠微生物進行以下分析。

2.2.1 Alpha多樣性

本研究采用Observed、Chao1指數評估菌群OTU數量，Shannon指數評估菌群多樣性。Observed、Chao1指數越高，菌群豐度越高；Shannon值越大，菌群多樣性越高。兩組中Observed、Chao1指數中位數具有顯著性差異，且化鐵丸中劑量組菌群豐度明顯高于對照組菌群（P＜0.05）；Shannon指數中位數在兩組中有明顯差異，且化鐵丸中劑量組菌群多樣性明顯高于對照組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 對照組與化鐵丸中劑量組糞便菌群Alpha多樣性箱型圖

2.2.2 β多樣性分析

β多樣性分析包括PCoA和PCA分析。紅色點與藍色點距離越接近則糞便菌群物種間的結構組成越相似，距離越遠表明菌群物種間結構組成差異越大。通過分析發現，PC1為22.88%、PC2為13.1%時，化鐵丸中劑量組與對照組樣本結構存在差異，提示兩組間腸道菌群明顯存在差異。說明中劑量化鐵丸可使腸道菌群組成結構發生改變。

2.2.3 組間微生物種類及其相對豐度分析

對微生物門水平的鑒定結果顯示菌群主要包括了5個菌門，包括擬桿菌門、厚壁菌門、Patescibacteria門、變形菌門、放線菌門，其中擬桿菌門和厚壁菌門占比超過90%，且與對照組比較，化鐵丸中劑量組的擬桿菌門、變形菌門豐度升高，厚壁菌門的豐度、Patescibacteria菌門、放線菌門降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4a。此外，化鐵丸中劑量組和對照組有19個屬水平上的細菌差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖4b。與對照組比較，化鐵丸中劑量組可以增加Muribaculaceae_norank、毛螺桿菌科LachnospiraceaeNK4A136group、瘤胃球菌科RuminococcaceaeUCG-014、毛螺菌科Lachnospiraceae_uncultured、瘤胃梭菌屬Ruminiclostridium、理研菌科Rikenella、Ruminiclostridium9、脫硫弧菌屬Desulfovibrio、Muribaculum的豐度，減少乳桿菌Lactobacillus、Odoribacter、Alistipes、CandidatusSaccharimona、瘤胃球菌科Ruminococcaceae_uncultured、擬桿菌屬、普雷沃氏菌科PrevotellaceaeUCG-001、腸桿菌屬Enterorhabdus、ClostridialesvadinBB60group_norank的豐度。

圖4 對照組與化鐵丸中劑量組間物種差異分析

2.2.4 LEfSe差異物種分析

為了確定具有統計學意義的生物標志物、揭示組內的優勢微生物，采用LEfSe軟件進行差異性分析。圖5a為聚類樹，紅色區域和綠色區域表示不同分組，樹枝中紅色節點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群，綠色節點表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群，黃色節點表示在兩組中均沒有起到重要作用的微生物類群，圓圈的直徑越大物種豐度最高。圖5b用線性判別分析效應大小，繪制LDA評分柱狀圖。LDA得分＞2時，其絕對值越大表示該物種對兩組差異影響越大，紅色代表在對照組顯著富集的物種，綠色代表在化鐵丸中劑量組中顯著富集的物種。

圖3 對照組與化鐵丸中劑量組糞便菌群β多樣性分析

圖5 對照組與化鐵丸中劑量組間LEfSe差異物種分析圖

研究發現差異顯著的菌種中，化鐵丸中劑量組中梭菌目Clostridiales、梭菌綱Clostridia、毛螺菌科Lachnospiraceae_FCS020_group、瘤胃球菌屬Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminiclostridium_5、Lachnoclostridium、Parasutterella的相對豐度較高；腸桿菌屬Enterobacter、乳酸菌目Lactobacillales、乳酸桿菌科Lactobacillaceae、桿菌綱Bacilli、乳酸桿菌屬Lactobacillus的相對豐度較低。

3 討論

中醫認為結腸癌是因人體正氣不足、陰陽失調，導致血瘀、痰凝、濕熱等邪毒交結于腸道所形成的腫瘤?！夺t宗必讀》中說：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”?！侗静菪缕份d威靈仙：“消腸中久積痰涎，除腹內癖氣塊?！辫鷮嵶泳哂小皦呀罟?、助陽氣、補虛勞、健腰膝”（《本草求真》）的功效。兩者一攻一補，一剛一柔，相得益彰，專治癥瘕腫塊，故云“化鐵”。近年來研究證明威靈仙提取物多糖對舌鱗癌Tca-8113細胞具有抑制作用［13］；威靈仙提取物威靈仙總皂苷（CCS）對小鼠移植性腫瘤S180、HepA、P388均有顯著的抑制作用［14］；楮實子總生物堿濃度達到60 mg/kg時對小鼠S180實體瘤、H22實體瘤和ESC實體瘤抑制作用最大，抑瘤率為40%［15］。

本研究顯示，化鐵丸具有明顯抑瘤效果，其中中劑量組的效果最好，腫瘤抑制率為44.0%，低劑量組為36.0%，高劑量組為32.1%。用藥期間對裸小鼠的體質量及正?；顒訜o顯著影響，說明化鐵丸無明顯不良反應。

本研究顯示化鐵丸中劑量組與對照組腸道微生物的優勢菌是厚壁菌門和擬桿菌門，占比超過90%，其次是Patescibacteria門、變形菌門、放線菌門等，這與其他研究基本一致［16-17］。糞便微生物多樣性分析顯示，相比于對照組，化鐵丸中劑量組可以提高腸道菌群的豐度和多樣性。LEfSe差異物種分析顯示，中劑量化鐵丸可以降低腸桿菌豐度。腸桿菌屬機會致病菌，部分腸桿菌如腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸產毒性大腸桿菌（ETEC）可以誘導腸道內炎癥反應，促進腸癌發生［18-19］；另一方面，可以產生基因毒性物質，破壞正常腸道細胞中的脫氧核糖核酸（DNA）分子，使基因發生突變，導致腫瘤發生［20-24］。中劑量化鐵丸明顯增加梭菌目Clostridiales的作用，研究顯示Clostridiales可抑制腸道內有害菌和腐敗菌的生長、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，產生的胞外可溶性多聚糖能完全抑制腫瘤生長［25-26］。除梭菌目外，中劑量化鐵丸還增加了毛螺菌科Lachnospiraceae_FCS020_group、瘤胃球菌屬Ruminococcaceae_NK4A214_group，均可產生丁酸鹽。丁酸鹽屬于短鏈脂肪酸，是維持能量穩態所必需的，丁酸不僅可以抑制丙酮酸脫氫酶合成、降低糖酵解能力、抑制腫瘤細胞能量供應，還可促進腫瘤細胞凋亡，降低炎癥因子的表達，抑制結腸炎，阻止腸癌發生［27-31］。故推測化鐵丸可能通過提高有益菌的豐度，促進腫瘤細胞凋亡，最終抑制腸癌發展。

本研究通過體外驗證實驗發現，化鐵丸可能通過提高裸小鼠腸道菌群的豐度及多樣性，提高Clostridiales菌豐度，抑制條件致病菌Enterobacter桿菌的豐度，抑制結腸癌發展。由于本實驗樣本量小，沒有通過無菌裸小鼠對差異菌進行驗證，結果在一定程度上存在偏倚，這也是團隊下一步要解決的問題。