LINC00707對脂多糖誘導的大鼠心肌細胞炎癥損傷的影響和機制△

王 佳，姜克東，周士進，龔 芳

［1.荊州市第二人民醫院急診2 科，湖北荊州 434000；2.湖北文理學院附屬醫院（襄陽市中心醫院）心內科，湖北襄陽 441021］

膿毒癥是一種全身性炎癥反應，可導致許多器官（包括心臟器官）功能障礙，嚴重膿毒癥的病死率高達20%～30%［1］。膿毒癥誘發的心肌病是膿毒癥和敗血性休克過程中普遍存在的并發癥之一。在細胞和分子水平上，炎癥、凋亡被認為是膿毒癥和膿毒癥心肌病的關鍵病理生理現象［2］。因此，研究膿毒癥心肌病的詳細機制有助于探索新的治療方案。來自革蘭氏陰性細菌的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導促炎和促凋亡活性，被公認為膿毒癥中最有特征的激活劑［3］。在這項研究中，LPS 被用來誘發膿毒癥。越來越多的證據表明，長度超過200 nt 的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）參與了膿毒癥［4］，探索lncRNA 在膿毒癥的病理生理過程中的機制可能有助于尋找有效的治療靶標。LINC00707 在幾種疾病中異常上調，并與炎癥反應和細胞凋亡相關［5-6］。然而，LINC00707 在膿毒癥中的功能仍不清楚。微小RNA（microRNA，miR）是長度為21-25 nt 的高度保守的非編碼RNA 分子。大量研究表明，膿毒癥中各種miR 的表達發生改變［7］。資料顯示，miR-338-3p 可抑制多種人類腫瘤的發生和發展，例如結直腸癌［8］、肺癌［9］。MiR-338-3p 也被證明在急性腎損傷下調［10］。在急性腦梗死患者中，血漿miR-338-3p 濃度下調，且miR-338-3p 與C 反應蛋白濃度負相關，其中C 反應蛋白是動脈粥樣硬化的關鍵炎癥因子［11］。但miR-338-3p 在膿毒癥發展過程中的功能需要進一步探索。這項研究旨在檢查LINC00707 對LPS 誘發的心肌細胞損傷的影響及其所涉及的潛在機制，以期在分子水平上為膿毒癥心肌病患者的治療提供希望。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究中包括的所有程序均已獲得荊州市第二人民醫院的機構審查委員會的批準。從參與者處獲得了書面知情同意書。于2018 年1 月至2019 年6 月，招募荊州市第二人民醫院確診收治的57 例膿毒癥患者作為研究對象。排除以下情況的患者：（1）最近3個月內接受免疫抑制藥物治療；（2）懷孕或哺乳；（3）嚴重的慢性疾病，如心臟、肝臟、腎臟和肺部；（4）患有實體腫瘤或血液系統惡性腫瘤；（5）人免疫缺陷病毒感染?；颊吲R床基線資料基本一致。從健康檢查中心招募57 名與膿毒癥患者年齡和性別相似，沒有全身性炎癥、無膿毒癥或其他嚴重感染病史、沒有腫瘤病史或心臟和腎臟功能障礙的健康志愿者，作為健康對照。從膿毒癥患者和健康對照中采集外周血樣本2 mL，3 000 r·min-1離心10 min分離血清樣品，保存在-80℃用于RNA提取。

大鼠心肌細胞H9C2（美國典型培養物保藏中心），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked im?munosorbent assay，ELISA）試劑盒、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（美國R＆D Systems），膜聯蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色試劑盒（美國BD Biosci?ence），活化半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved-caspase-3）兔抗（美國Abcam），聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國GE Health），PrimeScriptTMRT 試劑盒（日本寶日醫），SYBR GREEN qPCR Su?per Mix（美國Invitrogen），LINC00707 小干擾RNA（si-LINC00707）、陰性對照siRNA（si-NC）、miR-338-3p mimic/inhibitor（anti-miR-338-3p）、陰性對照（miR-NC/anti-miR-NC）（上海GenePharma）。

1.2 測定LINC00707 表達情況

使用Trizol 提取膿毒癥患者血清RNA。為了分析LINC00707，使用PrimeScriptTMRT 試劑盒將總RNA 反轉錄為cDNA，并將SYBR GREEN qPCR Super Mix 用于實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）。實驗中使用的引物序列如下：LINC00707 正向為5'-CCAACAGGGTATCAGAATTCTC-3'，反 向 為5'-TGCTGACAATAGCCATTAGG-3'；內 參GAPDH 正向為5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCAT-3'，反向為5'-GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'。使用Ap?plied Biosystems7500 檢測系統進行qRT-PCR。使用2-ΔΔCT方法計算LINC00707 的相對倍數變化。

1.3 細胞培養與脂多糖損傷

H9C2細胞在含有5%二氧化碳的培養箱中，于37℃并在補充有100 μg·mL-1鏈霉素、100 μg·mL-1青霉素和10%胎牛血清的Dulbecco's Modified Eagle培養基（DMEM）中培養。LPS損傷時，以10 μg·mL-1LPS 誘導24 h［12］復制膿毒癥模型。

1.4 實驗分組

H9C2 細胞分為NC 組（對照）、LPS 組（10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-NC 組（轉染si-NC+10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-LINC00707 組（轉染si-LINC00707+10 μg·mL-1LPS）、LPS+miR-NC 組（轉染miR-NC+10 μg·mL-1LPS）、LPS+miR-338-3p 組（轉染miR-338-3p mimic+10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組（轉染si-LINC00707 與anti-miRNC+10 μg·mL-1LPS）、LPS+si-LINC00707+antimiR-338-3p 組（轉染si-LINC00707 與anti-miR-338-3p+10 μg·mL-1LPS）。使 用Lipofectamine 2000 試劑進行上述轉染，24 h 后用10 μg·mL-1LPS誘導H9C2 細胞。

1.5 測定炎癥因子TNF-α、IL-6 的濃度

根據制造商推薦的方案，使用高靈敏度TNF-α ELISA 試劑盒、IL-6 ELISA 試劑盒分析H9C2 細胞培養上清液中TNF-α 和IL-6 的濃度。用酶標儀測量450 nm 處的光密度，并根據標準曲線分析炎癥因子TNF-α、IL-6 數據。

1.6 流式細胞儀檢測H9C2 細胞的凋亡

處理后，收集H9C2 細胞（1×106），用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，并重懸于500 μL 1×結合緩沖液中，然后與Annexin V-FITC（5 μL）和PI（10 μL）混合，將混合物在室溫下黑暗中放置15 min，并使用Beckman Coulter 流式細胞儀進行凋亡分析。

1.7 Western blot檢測cleaved-caspase-3蛋白的表達

在細胞裂解液中于4℃裂解H9C2 細胞30 min，并用二辛可寧酸法測定總蛋白。將等量的蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后轉移到PVDF 膜上。接下來，將PVDF 膜與一抗和二抗一起孵育。本研究中使用的一抗和二抗包括抗cleaved-caspase-3（1∶1 000 稀釋度）和IgG-HRP 二抗（1∶10 000 稀釋度）。β-肌動蛋白（β-actin；1∶1 000 稀釋度）用作上樣對照。最后，使用電化學發光溶液探測PVDF膜。通過Quantity One 軟件對蛋白條帶進行定量和分析。

1.8 雙熒光素酶活性實驗分析LINC00707 對miR-338-3p 的靶向調控

Stabase 軟件用于LINC00707 和miR-338-3p 的結合位點預測。構建含有miR-338-3p 結合位點的LINC00707-野生型（wild type，WT）及突變型（mutant type，MUT）片段，并將其克隆到psi-CHECK2載體中，分別命名為LINC00707-WT和LINC00707-MUT。使用Lipofectamine 2 000試劑在H9C2細胞中轉染miR-338-3p mimic 或miR-NC 和LINC00707-WT 及MUT 報告基因載體。使用Promega 雙熒光素酶報告基因測定系統測定48 h 后H9C2 細胞的海腎和螢火蟲的螢光素酶活性比。另轉染pcD?NA-LINC00707、pcDNA、si-LINC00707 和si-NC 于H9C2 細胞中，記為LINC00707 組、pcDNA 組、si-LINC00707 組 和si-NC 組，48 h 以qRT-PCR 測 定LINC00707 和miR-338-3p 表達。

1.9 統計學分析

在SPSS 22.0 軟件中進行數據的統計分析。計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間差異通過單因素方差分析進行，組間兩兩差異通過SNK-q檢測進行。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膿毒癥患者血清LINC00707 表達情況

57 例膿毒癥患者血清LINC00707 表達水平（2.14±0.25）比健康對照（1.00±0.13）增加了1.14 倍左右（t=30.544，P＜0.05）。

2.2 LPS 誘導的H9C2 細胞LINC00707 表達情況

在10 μg·mL-1LPS 誘 導 的H9C2 細 胞 中，LINC00707 表達水平（1.93±0.15）比對照NC（1.00±0.07）增加0.93 倍左右（t=16.855，P＜0.05）。

2.3 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達

LPS 組H9C2 細 胞 中LINC00707 表 達 水 平、TNF-α、IL-6 的濃度高于NC 組，并且cleaved-cas?pase-3 蛋白表達水平和細胞凋亡率也高于NC 組（P＜0.05）。H9C2 細胞轉染si-LINC00707 后，LPS+si-LINC00707組LINC00707表達水平、TNF-α、IL-6的濃度以及cleaved-caspase-3 蛋白表達水平、細胞凋亡率均低于LPS+si-NC 組（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達 ［n=9，±s］

表1 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達 ［n=9，±s］

注：與NC 組比較，*P＜0.05；與LPS+si-NC 組比較，1）*P＜0.05

圖1 si-LINC00707 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和cleaved-caspase-3 蛋白表達水平（A：流式細胞儀檢測H9C2 細胞的凋亡；B：Western blot 檢測cleaved-caspase-3 蛋白的表達）

2.4 LINC00707 靶向miR-338-3p，調控miR-338-3p 的表達

Stabase 軟件中預測的LINC00707 和miR-338-3p 靶向結合位點見圖2。MiR-338-3p 組轉染LINC00707-WT的H9C2細胞熒光素酶活性比miRNC組減少了0.58倍左右（P＜0.05），轉染LINC00707-MUT 的H9C2 細胞熒光素酶活性在miR-338-3p組與miR-NC 組之間無明顯差異（P=0.492），見表2。LINC00707 組H9C2 細 胞 的LINC00707 表 達 水 平（2.43±0.15）比pcDNA 組（1.00±0.08）增加，miR-338-3p 表達水平（0.45±0.03）比pcDNA 組（1.00±0.10）減少（P＜0.05），si-LINC00707 組H9C2 細胞的LINC00707 表達水平（0.34±0.01）比si-NC 組（1.02±0.09）減少（P＜0.05），miR-338-3p 表達水平（1.91±0.14）比si-NC 組（0.99±0.07）增加（P＜0.05）。

表2 miR-NC 或miR-338-3p mimic 與LINC00707 報告質粒共轉染H9C2 細胞后雙熒光素酶活性檢測 ［n=9，±s］

表2 miR-NC 或miR-338-3p mimic 與LINC00707 報告質粒共轉染H9C2 細胞后雙熒光素酶活性檢測 ［n=9，±s］

注：與miR-NC 組比較，*P＜0.05

圖2 Stabase 對LINC00707 和miR-338-3p 結合進行預測示意圖

2.5 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達

H9C2 細胞中轉染miR-338-3p mimc 后，LPS+miR-338-3p 組miR-338-3p 表達水平高于LPS+miR-NC 組，TNF-α、IL-6 的濃度以及cleaved-cas?pase-3 蛋白表達水平、細胞凋亡率均低于LPS+miR-NC 組（P＜0.05），見表3、圖3。

圖3 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和cleaved-caspase-3 的蛋白表達（A：流式細胞儀檢測H9C2細胞的凋亡；B：Western blot 檢測cleaved-caspase-3 蛋白的表達）

表3 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達 ［n=9，±s］

表3 miR-338-3p 抑制LPS 處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達 ［n=9，±s］

注：與LPS+miR-NC 組比較，*P＜0.05

2.6 anti-miR-338-3p 逆 轉si-LINC00707 對LPS處理的H9C2 凋亡和炎癥因子表達的影響

H9C2 細胞中轉染si-LINC00707 與anti-miR-338-3p 后，LPS+si-LINC00707+anti-miR-338-3p 組miR-338-3p 表達水平低于LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組，TNF-α、IL-6 的濃度以及cleavedcaspase-3 蛋白表達水平、細胞凋亡率均高于LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組（P＜0.05），見表4、圖4。

表4 anti-miR-338-3p 可以逆轉si-LINC00707 對LPS 處理的H9C2 凋亡和炎癥因子表達的影響 ［n=9，±s］

表4 anti-miR-338-3p 可以逆轉si-LINC00707 對LPS 處理的H9C2 凋亡和炎癥因子表達的影響 ［n=9，±s］

注：與LPS+si-LINC00707+anti-miR-NC 組比較，*P＜0.05

圖4 anti-miR-338-3p 逆轉si-LINC00707 對LPS 處理的H9C2 凋亡和cleaved-caspase-3 蛋白表達（A：流式細胞儀檢測H9C2 細胞的凋亡；B：Western blot 檢測cleaved-cas?pase-3 蛋白的表達）

3 討論

目前認為膿毒癥中的心肌損傷機制與炎性因子密切相關。革蘭氏陰性細菌是引起膿毒癥的主要病原體。這些細菌細胞壁中的LPS 是脂質和多糖復合物，可以激活單核細胞和巨噬細胞，引起許多病理生理變化，包括釋放大量促炎因子，例如TNF-α 和IL-6［13］。研究顯示，LPS 可通過升高心肌組織中TNF-α、IL-6 的濃度來加重膿毒癥小鼠的心臟功能障礙或H9C2 細胞的體外損傷［14］。此外，凋亡是膿毒癥和敗血性心臟病的關鍵原因［15］。本研究在LPS 刺激的H9C2 細胞模型中進行研究，發現LPS 治療可誘導H9C2 細胞中TNF-α、IL-6 的表達，增加細胞凋亡率和凋亡執行蛋白cleavedcaspase-3 表達，導致細胞凋亡和炎癥損傷，與前人研究［13，16］吻合。

本研究發現，膿毒癥患者血清和LPS 誘導的H9C2細胞中LINC00707上調，因此推測LINC00707在膿毒癥中起著至關重要的作用。研究表明，LINC00707調節癌細胞的增殖、凋亡和侵襲等［17-18］。根據報道，在LPS 處理的神經細胞PC-12 中，LINC00707 表達上調，LINC00707 的抑制通過靶向miR-30a-5p 減輕LPS 誘導的PC-12 細胞炎癥和細胞凋亡，具體表現為抑制LINC00707 降低IL-1β、IL-6 和TNF-α 的濃度，并抑制細胞凋亡［5］。在LPS 處 理 的MRC-5 細 胞 中，LINC00707 升 高，LINC00707 的敲低通過充當miR-223-5p 的海綿減輕MRC-5 細胞中LPS 觸 發 的 損 傷［6］。但 是，LINC00707 對膿毒癥心肌病炎癥和凋亡的作用仍不清楚。轉染si-LINC00707 敲減LINC00707 后，LPS 誘導的H9C2 細胞中TNF-α 及IL-6 的濃 度、cleaved-caspase-3 蛋白表達和凋亡率均降低，提示敲減LINC00707 減輕了LPS 誘導的炎癥和H9C2細胞凋亡，與前述報告類似。這些結果表明敲減LINC00707 在LPS 處理的H9C2 細胞中具有抗凋亡和抗炎作用。

此外，本研究還評估了LINC00707對LPS處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥發揮作用的潛在分子機制。lncRNA 可以充當miRNA 的分子海綿，并起競爭內源性RNA 的作用［19］。在結直腸癌中，LINC00707 通過使miR-206 變海綿促進增殖和轉移［20］。本實驗的機理研究表明，通過Stabase 和雙熒光素酶活性實驗分析，miR-338-3p 是LINC00707 的靶標。MiR-338-3p 在消炎中起重要作用，在LPS 處理的16HBE 細胞中，miR-338-3p 被下調，miR-338-3p過表達減弱了LPS 誘導的16HBE 細胞炎性損傷［21］。在心肌梗死中，H9C2 細胞與過表達miR-338 的外泌體共培養時，細胞凋亡率降低，caspase3熒光強度增加［22］。此外，miR-338 被鑒定為心肌細胞缺氧/復氧誘導的自噬和自噬細胞死亡的新型抑制劑［23］。本研究發現，LINC00707 與miR-338-3p 靶向結合，并負調控miR-338-3p 表達。miR-338-3p mimc 降低LPS 誘導的H9C2 細胞中TNF-α 及IL-6 的濃度、cleaved-caspase-3 蛋白表達水平和細胞凋亡。另外，si-LINC00707 抑制LPS處理的H9C2 細胞凋亡和炎癥因子表達的效果被anti-miR-338-3p 所逆轉，這表明敲減LINC00707通過上調miR-338-3p 來抑制LPS 誘導的心肌細胞凋亡和炎癥。

綜上所述，本研究證明了LINC00707 在膿毒癥患者血清和LPS 誘導的心肌細胞中高表達，敲減LINC00707 通過靶向miR-338-3p 來治療LPS 引起的心肌細胞炎性損傷和細胞凋亡，這可能為膿毒癥心肌病的治療鋪平了道路。