基底剛度對基于納米顆粒的阿霉素內吞影響的研究

賈冠杰,孔金龍,楊莎莎,張玉原,楊慧圓,杜瑤瑤,王楷群,趙志換,陳維毅

(太原理工大學 生物醫學工程學院，太原030024)

化療是癌癥治療的重要手段。阿霉素是臨床上常用的廣譜化療藥物。由于其水溶性差、非靶向性以及用藥導致的心臟毒性[1]，所以將阿霉素靶向運輸到病灶區域對于提高阿霉素的治療效率以及減輕副作用具有重要意義[2-5]?；诩{米載藥技術的阿霉素(doxorubicin，DOX)輸運增強了機體內阿霉素在靶向區域的吸收和分布，提高了殺傷癌細胞的能力，減少了藥物對于正常組織的不良反應[6-9]。載有DOX的聚合物-脂質混合納米粒子(polymer-lipid hybrid nanoparticle，PLN)比游離的DOX更容易向細胞內進行轉運[10]?；赥iO2納米顆粒的DOX運輸可以使得MCF-7細胞中藥物積累量增加約2.4倍[11]。Ge-DOX-5-ALA/NPs納米顆?？梢岳媚[瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)觸發釋放藥物，以成功地將DOX轉運到腫瘤部位[12]。復雜的腫瘤微環境對于阿霉素的靶向運輸有著顯著影響。包裹于乙二醇殼聚糖上的阿霉素的輸運受到微環境酸堿度的影響，當pH值為5時靶向區域處釋放出來阿霉素的熒光強度最大[13]。缺鐵微環境中影響基于聚乙烯醇的DOX輸運，當加入轉鐵蛋白配體之后，腫瘤細胞對于載藥顆粒的攝取率顯著提高[14]。因此，研究復雜腫瘤微環境對于改善化療效果有重要意義。

在眾多腫瘤微環境因素中，腫瘤力學微環境(例如細胞外基質剛度)對于腫瘤發展進程以及治療有著重要影響。轉移性癌細胞的細胞外基質與正常組織的細胞外基質剛度相比顯著降低[15-16]?；|中膠原蛋白水平的增加導致的腫瘤內血管受壓和灌注不足使得到達腫瘤部位的化療藥物濃度降低[17]。致密性的基質阻礙了較大尺寸(>60 nm)的納米載藥顆粒輸運到腫瘤處進而影響治療效果[18]。在特定剛度的基質中紫杉醇更容易被乳腺癌細胞吸收[19-21]。在剛度為105 kPa的基質中肝癌細胞對于順鉑的耐藥性最強[22]。針對于在腫瘤發展進程中伴隨的基質剛度變化的研究能夠為提高化療藥物利用效率提供潛在幫助。

包裹于載藥顆粒上的化療藥物向內輸運的效率與細胞的內吞作用有關。已有研究表明基質剛度對于細胞內吞作用有調控作用。較硬的基質會抑制MK2抑制劑肽的吸收[23]?；讋偠鹊脑黾訒沟脝挝幻娣e上的乳腺癌細胞對于載有藥物C6的F127MM納米顆粒的攝取效率降低[24]。軟基質上培養的MCF-7細胞顯著提高了對于細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)的吸收[25]?；|剛度能夠影響基質細胞對于癌細胞膜釋放的微泡(microvesicles，MVs)的吸收效率[26]。由此看來，研究細胞外基質剛度對細胞內吞作用的影響有助于提高基于納米載藥技術的藥物利用率，進而增強化療藥物的治療效果。

在本研究中，探索了細胞黏附基底剛度對于基于納米載藥顆粒技術的阿霉素內吞作用的影響。具體內容有：1)探索了包裹在納米載藥顆粒上的DOX的輸運對于不同PDMS基底剛度上的Hela細胞存活率的影響。2)研究了基底剛度對HeLa細胞中網格蛋白介導的內吞作用的影響。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)納米粒子可以負載抗癌藥物DOX并通過內吞作用進入細胞。通過HeLa細胞吸收DOX的效率分析了底物剛度介導內吞作用的機制。檢測HeLa細胞的活性和介導內吞作用的整合素αVβ5和蛋白NUMB在不同剛度的PDMS基底上表達。本工作發現ECM剛度的變化會影響細胞的內吞作用，合適的剛度(楊氏模量范圍在0.578 MPa～1.986 MPa)可以使納米載藥達到更顯著的治療腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

PDMS(基料、固化劑)購自Dow Corning公司(美國)；DMEM培養基和FBS胎牛血清購自Gibco公司(美國)；CCK8檢測試劑盒購自Dojindo公司(日本)；鹽酸氯丙嗪(內吞抑制劑CPZ)；DOX阿霉素購自MedChemExpress公司(中國)；一抗Anti-Integrin alpha V+beta5(1∶200)、NUMB單克隆抗體(1∶100)和二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自abcam公司(美國)；一抗NUMB多克隆抗體購自Thermo-Fisher公司(美國)；二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)、Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)、β-肌動蛋白-HRP兔單克隆抗體、DAPI和BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天公司(中國)。

1.2 載藥納米顆粒和不同剛度的PDMS基底制備與力學性能測試

制備了聚乙烯吡咯烷酮PVP納米粒子以攜帶DOX.先將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)與葡萄糖在160 ℃混合制備CTAB-C，再將CTAB-C與30 mL丙酮在油浴中混合得到脫模板的C(RC)納米材料，加入酒精通過超聲波合成W18O49@RC，最后將PVP和W18O49@RC均勻分散在酒精中，充分攪拌并離心得到PVP-W18O49@RC納米顆粒。制備的載藥納米顆粒顯示出了良好的生物兼容性。具體細節見文獻[27].

實驗中使用了5種不同剛度的PDMS.先將PDMS基料與固化劑分別按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶30的質量比混合在6孔板中，再用真空干燥箱除去微小氣泡，最后放入80 ℃烘箱中固化。采用電子機械儀測量了PDMS基底的楊氏模量。電子機械儀負載速度為100 mm/min，最大載荷為50 N.

1.3 PVP納米顆粒和PDMS上的DOX負載

將1 mg PVP納米顆粒和1 mmol/L DOX溶液分別分散于超納米純蒸餾水(1 mL)中，再將上述溶液混合在室溫下暗區攪拌。將載有DOX的納米粒子離心并用超納米純蒸餾水進行洗滌，每一次都收集DOX上清液以測量DOX的載量。用紫外-可見分光光度計測量加載后的上清液DOX溶液。公式(1)用于計算DOX的負載[28]。

(1)

其中,amount of loaded drug是指加載到PVP納米顆粒上的DOX量。

將DOX溶于1 mmol/L的PBS溶液中，用DMEM稀釋10倍至終濃度為100 μmol/L.將3 mL濃度為100 μmol/L的DOX溶液加入不同組別的PDMS中，浸泡48 h.用紫外-可見分光光度計測定培養基上清液的紫外吸收光譜。

1.4 細胞培養

研究中使用了人宮頸癌細胞系(HeLa；ATCC編號為CCL-2).HeLa細胞培養于DMEM培養基中，置于37 ℃，體積分數5%CO2培養箱中培養。將5種不同硬度的PDMS基底進行消毒后，再將細胞溶液移入5組基底中，孵育48 h.

1.5 PDMS和內吞抑制劑CPZ的細胞毒性

PMDS和CPZ的細胞毒性通過CCK-8試劑盒表征。5組PDMS底物和對照組上的HeLa細胞密度均為105/mL.37 ℃培養48 h后，一組加入內吞抑制劑CPZ，37 ℃再培養1 h，后加入2 mL的50 μg/mL DOX或PVP/DOX培養18 h.將200 μL CCK-8溶液加入到含有2 mL培養基的每個培養皿中。將細胞在37 ℃下進行孵育。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。每次測量重復3次。

1.6 PVP/DOX復合物的細胞攝取

DOX具有紅色熒光特性。為了定位DOX，使用熒光顯微鏡進行標記。為了方便顯微分析，將HeLa細胞接種在具有不同硬度PDMS的24孔板中，保證每孔約105個細胞，并置于37 ℃，體積分數5% CO2培養箱中培養48 h.一組用PVP/DOX復合物(50 μg/mL)處理18 h，另一組細胞先用CPZ(25 μg/mL)處理1 h，然后加入PVP/DOX處理18 h.熒光顯微鏡觀察前，用PBS洗滌細胞以除去游離的DOX.用ImageJ軟件分析每個基板上細胞的熒光強度。

1.7 免疫熒光染色

整合素αVβ5和網格蛋白銜接蛋白NUMB是網格蛋白依賴性內吞作用中的兩種重要蛋白質。本研究探測了接種在不同剛度PDMS基質上的細胞αVβ5和NUMB的形態。向HeLa細胞中加入體積分數1%BSA，37 ℃孵育30 min.再將體積分數1% BSA稀釋的一抗Anti-Integrin alpha V+beta5(1∶200)和NUMB單克隆抗體(1∶100)加入細胞溶液中，并在4 ℃下保持過夜。用PBS(1∶500)稀釋的二抗Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)和Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)加入細胞溶液中并維持4 h.然后使用DAPI染色細胞核。最后將染色的細胞洗滌并在熒光顯微鏡下觀察。使用ImageJ軟件分析每個基板上細胞的熒光強度。對于每個基板，分析不少于100個細胞的至少5個區域。每個區域分析3次并取平均值以減少錯誤。

1.8 Western Blot檢測蛋白質表達

將培養的細胞進行裂解。裂解物在冰上孵育，再在4 ℃、15 000 g下離心以收集上清液。參照BCA蛋白定量試劑盒說明書，測定各組蛋白濃度。上樣等量蛋白，體積分數10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用含有0.2%吐溫-20和5%脫脂奶粉的PBS封閉，并用兔單克隆抗NUMB抗體(1∶1 000)和抗β-肌動蛋白(1∶2 000)印跡過夜。用PBS洗膜，將蛋白質與山羊抗兔IgG H&L(HRP)和β-肌動蛋白-HRP兔單克隆抗體(1∶5 000) 室溫孵育1 h.使用蛋白質印跡數字成像儀對條帶進行可視化。

1.9 統計分析

所有定量結果均以平均值±標準差(SD)表示，在Origin軟件中采用Tukey顯著性檢驗評價組間差異。*表示兩組數據存在差異(*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001)，0.05表示顯著差異，N.S表示無顯著差異。所有生物學實驗均重復3次。

2 結果和討論

2.1 PDMS基底的剛度特性

通過拉伸試驗測試了5種配比的PDMS基底力學性能，PDMS的應力-應變曲線如圖1(a)所示。通過擬合曲線前10%的斜率得到了不同質量比的PDMS的楊氏模量(圖1(b))。結果表明，調控PDMS配比能夠影響其力學性能，抗拉強度會隨著質量比的增加而增加。質量比為1∶30的PDMS最軟，楊氏模量為0.447 MPa，而質量比為1∶5的PDMS剛度最大，楊氏模量為2.38 MPa.質量比為1∶20，1∶15和1∶10的PDMS楊氏模量分別為0.578 MPa，0.815 MPa和1.986 MPa.

圖1 不同質量比PDMS基材的冷拉伸性能Fig.1 Cold-drawn tensile properties of PDMS substrates with different mass ratios

2.2 不同剛度PDMS的DOX負載能力

采用紫外-可見分光光度計測量了不同配比的PDMS基底上DOX的吸附特性。分別測定DOX溶液，DMEM溶液以及各組不同剛度PDMS基底負載DOX 48 h后上清液的紫外吸收光譜特性。不同組別的吸光度曲線如圖2所示。DOX在480 nm處表現為強吸收峰，這與文獻[29]結果相類似。DMEM在430 nm處表現為強吸收峰。而各組PDMS基底上的DOX負載能力沒有明顯的差異，這說明不同剛度的PDMS基底不會影響游離的DOX負載能力。

圖2 負載DOX 48 h后不同組的紫外吸收特性曲線Fig.2 UV absorption characteristic curve of different groups after loading DOX for 48 h

2.3 PVP納米粒子的DOX負載能力

將PVP納米顆粒加到DOX溶液中磁性攪拌48 h，然后吸出上清液進行紫外-可見分光光度法測定。如圖3所示，DOX和載藥后PVP/DOX復合物的紫外吸收光譜分別以紅線和藍線表示。DOX和PVP/DOX復合物的吸收光譜在480 nm處有明顯的吸收帶，但PVP/DOX復合物的吸收光譜強度大大低于純DOX溶液，這是由于藥物已被加載到PVP粒子上。根據式(1)計算得出，PVP粒子的載藥量約為100 μmol/L.

圖3 采用紫外-可見分光光度法測定DOX在PVP顆粒上的負載能力Fig.3 Loading capacity of DOX on PVP particles measured by UV-vis spectrophotometry

2.4 DOX的細胞內攝取和分布

為了評估PVP在細胞內的攝取情況并證明PVP納米顆?？梢酝ㄟ^特定的內吞途徑被內化到靶細胞中，研究了PVP/DOX復合物在HeLa細胞中的內吞行為和內吞途徑。在正常條件和內吞抑制條件下，通過熒光倒置顯微鏡監測DOX的紅色熒光來定位不同剛度的PDMS基質上培養的細胞中PVP/DOX顆粒。在藥物孵育18 h后，對照組和不同剛度PDMS基底上DOX的大部分紅色熒光均勻分布在細胞內，少量DOX分布在細胞膜周圍；而在先用抑制劑CPZ預處理1 h再孵育藥物后，各組細胞膜外而不是細胞內出現鮮紅色熒光(圖4).結合兩組實驗分析，PVP納米粒子可以被細胞內化吸收，并通過網格蛋白介導的內吞途徑被細胞有效吸收。

圖4 網格蛋白內吞抑制劑(CPZ)改變了載藥納米顆粒在HeLa細胞內的內化吸收，加入抑制劑后DOX熒光在細胞膜邊緣聚集Fig.4 Clathrin endocytosis inhibitor(CPZ) changing the internalization absorption of drug-loading nanoparticles in HeLa cells，and DOX fluorescence assembled at the edge of cell membrane after adding the inhibitor

2.5 藥物和內吞抑制劑影響細胞活性

為了探究基底剛度對內吞作用的影響，第一組加入游離DOX培養18 h，第二組先加入內吞抑制劑CPZ，然后加入PVP/DOX復合物培養18 h，第三組不加抑制劑，直接加入PVP/DOX復合物培養18 h.3組CCK-8結果如圖5所示。發現在不加入DOX的情況下，不同剛度的PDMS基底對細胞生長沒有影響。在僅添加游離DOX的條件下，可以看到DOX對細胞有一定的殺傷作用，但不同剛度組仍沒有表現出明顯差異。對加入PVP/DOX復合物的兩組數據進行分析后發現，與僅添加游離DOX組對比，添加內吞抑制劑組細胞活性增加，而未添加內吞抑制劑組細胞活性顯著降低，不同剛度組間存在統計學差異。質量比為1∶10、1∶15和1∶20的PDMS基底上的細胞活性低于質量比為1∶5和1∶30的PDMS基底上的，這說明較硬和較軟的基底不利于細胞的內吞作用，從而減少了PVP/DOX顆粒擴散進入細胞，而中等剛度的基底有利于納米顆粒進入細胞。因此，適當的基底剛度能夠提高納米顆粒的給藥效率，這在給藥系統的實際應用中起著重要的作用。

圖5 分別添加游離DOX、細胞內吞抑制劑CPZ和PVP/DOX、PVP/DOX的不同剛度PBMS基底對Hela細胞活力的影響 Fig.5 Effects of PBMS substrate with different hardness on Hela cell viability by adding free DOX，endophage inhibitors CPZ, and PVP/DOX，PVP/DOX

2.6 整合素αVβ5和銜接蛋白NUMB分布和強度的變化

免疫熒光染色用于表征在不同基質上培養的HeLa細胞的細胞核(DAPI，藍色通道)、整合素(αVβ5，綠色通道)和網格蛋白銜接蛋白(NUMB，紅色通道)的共定位(圖 6).最近的研究表明，整合素αVβ5位于網格蛋白介導的內吞結構中，可以更好地將網格蛋白錨定在底物上，促進內吞作用[30-31]。內吞過程中，NUMB充當網格蛋白銜接蛋白，將網格蛋白與整合素連接來引導內吞[32-34]。如圖6所示，各組整合素αVβ5蛋白分布無明顯變化，但在對照組和1∶10、1∶15、1∶20的PDMS底物上可觀察到NUMB蛋白的高亮簇分布與其他組不同。

圖6 不同基底剛度對αVβ5和NUMB表達的影響Fig.6 Effects of different substrate stiffness on the expression of αVβ5 and NUMB

圖7熒光定量分析表明整合素αVβ5在1∶10 PDMS基底上的表達較高，NUMB蛋白在3種中等剛度基底上的表達顯著高于其他組，且NUMB蛋白在1∶15 PDMS基底上具有最高的熒光強度。結合2.5節中的結果，可得知兩種蛋白的高表達,尤其是NUMB，促進了網格蛋白介導的內吞作用，從而增加了載藥納米粒進入細胞的能力，增強了藥物對癌細胞的殺傷作用。

圖7 HeLa細胞內吞蛋白整合素αVβ5和NUMB表達的定量分析Fig.7 Quantitative analysis of HeLa cell endocytosis protein integrin αVβ5 and NUMB expression

2.7 NUMB蛋白表達的定量分析

為了進一步評估基底剛度對HeLa細胞內吞途徑的影響，以β-actin(42 ku)為內參蛋白，采用Western blot探索網格蛋白銜接蛋白NUMB(72 ku)在不同底物中的活化和表達情況。Western blot結果如圖8(a)所示，圖8(b)顯示了蛋白質條帶的歸一化數據。與免疫熒光染色結果類似，Western blot顯示NUMB蛋白在質量比為1∶15 PDMS基底上的表達水平最高，比對照組高近1.5倍(圖8(b)).除此之外，NUMB蛋白在質量比為1∶20 PDMS基底上的表達水平也高于對照組，而1∶5和1∶30的數據最低。這些結果與細胞活性測試一致，表明在特定剛度的基底上NUMB的蛋白表達水平發生變化，這可能是不同剛度基底上網格蛋白介導的內吞作用發生變化的原因。因此，基底剛度可用于調節NUMB蛋白的表達以抑制或促進 HeLa細胞的內吞作用。

圖8 不同剛度底物對HeLa細胞內吞途徑中的NUMB蛋白的影響Fig.8 Effects of different stiffness substrates on NUMB proteins in the endocytic pathway of HeLa cells

3 結論

細胞的內吞作用可作為研究納米載藥治療腫瘤的一個關鍵步驟，而細胞和基底之間的相互作用可能會影響細胞內吞作用的效率。在研究中，以HeLa細胞為研究對象，研究了5種不同剛度的PDMS基底如何調節HeLa細胞的阿霉素內吞行為。實驗結果顯示PDMS基底剛度的變化對于阿霉素的負載能力無影響，表明剛度調節下的HeLa細胞的活性改變與初始阿霉素濃度無關。納米顆粒介導的阿霉素的內吞行為受基底剛度調控，在剛度為0.578 MPa，0.815 MPa和1.986 MPa基底上呈現出胞內阿霉素濃度高以及細胞活性差。通過免疫熒光染色和Western Blot實驗發現，與內吞作用相關的整合素αVβ5，銜接蛋白NUMB蛋白表達的變化受基底剛度的調控，使得阿霉素的內吞效率變化，進而影響阿霉素殺傷腫瘤細胞的效果。剛度調控的αVβ5和NUMB表達的升高促進了胞內阿霉素濃度的提高，與HeLa細胞活性變差的結果一致。該研究為優化納米載藥材料以實現更高療效提供了潛在基礎，并為更好的癌癥治療提供了有用的視角。