碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗及報告專家共識

丁 麗， 陳佰義， 李 敏， 倪語星， 單 斌， 蘇丹虹， 孫自鏞， 王明貴， 楊啟文，喻 華， 俞云松0， 張利俠， 張 嶸， 朱德妹， 卓 超， 胡付品

1 前言

碳青霉烯類抗菌藥物包括亞胺培南、美羅培南和厄他培南等，是治療多重耐藥革蘭陰性菌所致感染最有效的抗菌藥物之一。隨著該類藥物在臨床的廣泛使用，碳青霉烯類耐藥細菌（carbapenemresistant organisms， CRO）的檢出率呈逐年上升趨勢，其中以肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌為代表。CHINET中國細菌耐藥監測網2021年監測結果顯示，我國臨床分離肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對亞胺培南的耐藥率分別為23.1%、23%和71.5%[1-2]。由于CRO通常還攜帶對其他抗菌藥物耐藥的基因，呈廣泛耐藥甚至全耐藥的特征，使臨床的抗感染治療面臨無藥可用的困境，導致感染患者的高病死率。CRO感染治療面臨的困境急需實驗室開展聯合藥敏試驗[3-11]，多藥聯合治療可延長抗菌藥物的使用壽命[12]，體外聯合藥敏試驗證實兩藥呈協同或相加作用的聯合，能有效改善CRO感染患者的病死率。聯合藥敏試驗可通過兩藥/多藥組合分析不同藥物之間的協同抗菌活性，在篩選針對CRO菌株所致感染的精準抗感染治療方案中發揮重要作用。為規范碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌聯合藥敏試驗及報告，上海市微生物學會微生物耐藥防控專委會、CHINET中國細菌耐藥監測網和上海市細菌真菌耐藥監測網組織專家對上述問題進行了討論，撰寫了專家共識并對聯合藥敏試驗方法和結果報告進行了推薦，以期對各醫療機構開展針對CRO菌株的聯合藥敏試驗及報告提供幫助。

2 CRO的定義及耐藥機制

碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌（carbapenemresistantEnterobacterales）定義為滿足以下任意一個條件[13]：①對亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者。對于天然對亞胺培南敏感性降低的細菌（如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等），需參考除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物的藥敏結果；②產生碳青霉烯酶。碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa， CRPA）和碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistantAcinetobacter baumannii，CRAB）定義為對亞胺培南、美羅培南或多利培南任何一種碳青霉烯類抗菌藥物耐藥者[14]。產生碳青霉烯酶是腸桿菌目細菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥最主要的機制[15]，包括A類絲氨酸碳青霉烯酶（以KPC酶為主）、B類金屬β內酰胺酶（以NDM型金屬酶為主）和D類絲氨酸碳青霉烯酶（以OXA-48型酶為主）。銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制包括AmpC酶高表達合并外膜滲透屏障、外排泵高表達以及產生碳青霉烯酶（包括KPC型碳青霉烯酶和金屬β內酰胺酶）等。鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類耐藥的主要機制是天然產生OXA-23、OXA-24或OXA-51型酶。

3 開展聯合藥敏試驗的時機

僅當藥敏試驗結果顯示細菌對常規所有測試的抗菌藥物均耐藥，或臨床醫師有特殊治療需求時，開展聯合藥敏試驗篩選可能的多藥聯合治療方案。開展聯合藥敏試驗的時機參考圖1。

圖1 聯合藥敏試驗時機及結果報告流程

4 聯合藥敏的方法及其局限性

當前臨床微生物實驗室常規采用的藥敏試驗方法包括肉湯微量稀釋法、肉湯宏量稀釋法、瓊脂稀釋法、E試驗法、自動化藥敏儀器和紙片擴散法。除紙片擴散法為定性檢測方法外，其余均為定量檢測方法。聯合藥敏試驗方法包括肉湯微量稀釋棋盤法、瓊脂稀釋棋盤法、紙條法（包括E試驗條和MTS條）、紙片擴散法和聯合殺菌曲線等[16-21]。肉湯微量稀釋棋盤法和瓊脂稀釋棋盤法是聯合藥敏試驗的標準參考方法，但該方法操作繁瑣且基本為手工操作，導致常規實驗室開展的可操作性差。因此，操作簡單靈活的紙條法和紙片法不失為常規實驗室聯合藥敏可選擇的方法。

專家共識一：聯合藥敏試驗是臨床微生物室常規藥敏試驗的補充，僅對多重耐藥菌如碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌或臨床醫師有特殊治療需求的耐藥菌株進行聯合藥敏試驗，其他菌株不建議常規開展聯合藥敏試驗。

專家共識二：聯合藥敏試驗方法首選肉湯微量稀釋棋盤法，若實驗室無法開展肉湯微量稀釋棋盤法，可以紙條法或紙片擴散法替代。但需注意的是，紙條法或紙片擴散法結果僅供參考，如需確認應采用肉湯微量稀釋棋盤法。

5 聯合藥敏試驗結果判讀

常用部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index， FIC） 為 判 斷 依 據[18-19]， 即①FIC≤0.5：協同作用，提示兩種藥物聯合后的抗菌活性顯著大于各單藥；②FIC＞0.5～1：相加作用，提示兩種藥物聯合后的抗菌活性較各單藥稍有增加；③FIC＞1～2：無關作用，提示兩種抗菌藥物的活性均不受另一種藥物的影響；④FIC＞2：拮抗作用，提示一種抗菌藥物的活性被另一種抗菌藥物削弱。

FIC指數計算公式：

專家共識三：在進行聯合藥敏試驗前，應先進行單藥的藥敏試驗，優先選擇敏感的抗菌藥物進行聯合，或以兩藥MIC值為中心，上下3～4個濃度進行交叉聯合，開展聯合藥敏試驗。

6 聯合藥敏試驗方案推薦

由于不同種類的抗菌藥物對產生不同碳青霉烯酶菌株的體外抗菌活性不同，不同耐藥菌由于耐藥機制的差異導致其對抗菌藥物的敏感性不同。因此，應根據不同的CRO菌株制定不同的抗感染治療方案。如頭孢他啶-阿維巴坦對于產KPC酶或OXA-48型酶腸桿菌目細菌具有高度抗菌活性，但對于產金屬酶菌株需聯合氨曲南；替加環素對碳青霉烯類耐藥腸桿菌目細菌和鮑曼不動桿菌具有高度抗菌活性，但對銅綠假單胞菌無抗菌活性；而多黏菌素（包括多黏菌素B和黏菌素）對上述三種耐藥菌均具有高度抗菌活性（天然耐藥菌株除外）。除此之外，磷霉素對腸桿菌目細菌具有較強抗菌活性，但對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌基本無抗菌活性；阿米卡星對CRO菌株具有一定抗菌活性，需根據藥敏試驗情況而定；而頭孢哌酮-舒巴坦（尤其是舒巴坦加大劑量）對于CRAB仍具有一定抗菌活性[22-23]?；诖?，實驗室在開展針對CRO菌株的聯合藥敏試驗時，需根據不同耐藥菌的特征而設計針對性的多藥聯合藥敏試驗方案。

專家共識四：各實驗室應根據本院CRO菌株耐藥機制，制定不同聯合藥敏試驗的抗菌藥物組合。

專家共識五：對于新β內酰胺類抗生素-β內酰胺酶抑制劑復方制劑，如頭孢他啶-阿維巴坦、美羅培南-韋博巴坦和亞胺培南-瑞來巴坦等，若藥敏試驗結果顯示對該類復方制劑敏感，可直接用于敏感菌所致感染的治療，無需開展聯合藥敏試驗。

專家共識六：對于不同CRO菌株聯合藥敏試驗抗菌藥物的選擇，應參考臨床抗感染治療指南或專家共識確定，具體參考表1[22-30]。

表1 CRO聯合藥敏試驗抗菌藥物組合推薦

7 聯合藥敏試驗方法學簡介、優缺點和結果判讀（表2）

表2 不同聯合藥敏試驗方法學簡介、結果報告、抗菌作用、優缺點、結果判讀和推薦級別

7.1 肉湯微量稀釋棋盤法

肉湯微量稀釋棋盤法[16-17]用于測定抗菌藥物抑制或殺滅微生物的最低濃度，通常以mg/L為單位?？咕幬顰和抗菌藥物B經倍比系列稀釋后，以不同濃度組合進行混合，經過孵育后閱讀單藥及兩藥聯合后的MIC。肉湯微量稀釋法使用的96孔微量板在最終接種完成后通常每孔中液體終體積為0.1 mL，細菌終濃度為5×105CFU/mL。作為參考方法，肉湯微量稀釋棋盤法可精確測定細菌對抗菌藥物的敏感性，明確兩藥之間是否存在協同、相加、無關和拮抗作用（圖2和圖3）。但該方法比較耗時，工作量大且對方法學技術要求高，因此一般僅用于科學研究，常規實驗室通常較少開展。

圖2 肉湯微量稀釋棋盤法協同、相加示意圖

圖3 肉湯微量稀釋棋盤法無關、拮抗示意圖

7.2 瓊脂稀釋棋盤法

瓊脂稀釋棋盤法[31]是將兩種抗菌藥物分別配制成單獨的不同濃度的溶液，之后以不同的兩藥藥物濃度組合加入到每一塊瓊脂平板中，配置成含抗菌藥物濃度成倍比系列稀釋的藥物平板。使用多點接種器將制備好的細菌菌懸液點種到瓊脂表面，經35℃ 16～20 h培養后，肉眼觀察細菌生長，以未見細菌生長平板的最低藥物濃度為MIC（圖4）。其優點是每個平板可同時測定多株細菌，可直接觀察受試菌生長是否良好或污染等。但該方法與肉湯微量稀釋棋盤法一樣比較耗時，工作量大且對方法學技術要求高，因此一般僅用于科學研究，常規實驗室通常較少開展。

圖4 瓊脂稀釋棋盤法示意圖

7.3 紙條法

紙條法[17，21，32-34]亦稱梯度擴散法，所用材料名稱為E試驗條（Epsilometer， E-test）和MIC測試條（MIC test strip， MTS），是一種商品化的定量測定細菌對抗菌藥物敏感性的方法。它結合了稀釋法和擴散法的原理和特點，操作同紙片擴散法一樣簡便易行，結果又如同稀釋法一樣，可獲得定量的MIC值，結果準確，重復性好。紙條法包括兩種：①紙條優加法，操作時在一塊已涂布菌液的MHA平板上貼上含抗菌藥物A和抗菌藥物B的紙條；在另一塊已涂布菌液的MHA平板上先貼上含抗菌藥物A的紙條，30 min后，待抗菌藥物A完全滲透入瓊脂中后移去紙條，再在相同的位置覆蓋貼上抗菌藥物B。過夜孵育后閱讀抗菌藥物A單藥、抗菌藥物B單藥以及抗菌藥物A和抗菌藥物B堆疊后的MIC（圖5）。②紙條交叉法：抗菌藥物A和抗菌藥物B紙條垂直交叉放置（單藥MIC處交叉，因此需提前測定單藥MIC），孵育后閱讀聯合后抗菌藥物A和抗菌藥物B的MIC，計算FIC指數，判斷兩藥是否存在協同、相加、無關和拮抗作用（圖6）。紙條法具有操作簡單的特點，且結果容易閱讀。

圖5 紙條優加法聯合藥敏試驗

圖6 紙條交叉法聯合藥敏試驗

專家共識七：兩藥協同定義為該菌對抗菌藥物A和抗菌藥物B單藥均為耐藥，但抗菌藥物B在抗菌藥物A存在時表現為敏感或中介。

7.4 紙片擴散法[16-17]

7.4.1 常規紙片擴散法 將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物吸收瓊脂中的水分后向紙片周圍擴散，隨著擴散距離的增加抗菌藥物的濃度呈對數減少，在紙片的周圍形成遞減濃度梯度。在紙片周圍抑菌濃度范圍內的測試菌不能生長，而抑菌濃度范圍外的菌株則繼續生長，從而在紙片的周圍形成抑菌圈。操作時將兩張不同抗菌藥物的藥敏紙片以一定的距離放置，參考距離為一張紙片的邊緣距離另外一張紙片的抑菌圈邊緣3～4 mm。經過孵育后根據兩藥間的抑菌圈擴大或縮小等現象，判斷兩藥是否存在協同、相加、無關或拮抗現象（圖7和圖8）。紙片擴散法具有操作簡單且價格低廉的特點，但缺點是結果不易閱讀。紙片擴散法聯合藥敏試驗兩藥敏紙片的距離可參考圖8。若常規紙片擴散法聯合藥敏試驗結果模糊，難以判斷，建議使用其他方法（如肉湯微量稀釋棋盤法、紙條法）進行確認。

圖7 紙片擴散法聯合藥敏試驗圖示

圖8 紙片擴散法聯合藥敏試驗兩藥敏紙片距離示意圖

優先選擇敏感的抗菌藥物A作為關鍵藥物與其他抗菌藥物進行聯合，如頭孢他啶-阿維巴坦、替加環素或多黏菌素。

7.4.2 紙片優加法 紙片優加法[32]為常規紙片擴散法的改良方法。實驗時按圖示先將2張含抗菌藥物A單藥和1張含抗菌藥物B單藥紙片貼在已接種菌液的MH瓊脂表面，3張紙片間的中心距離為25 mm。放置30 min后，待紙片中的抗菌藥物完全滲透入瓊脂中后，按圖示移去一張A紙片，再在相同的位置上覆蓋貼上抗菌藥物B單藥紙片。經孵育后閱讀抑菌圈直徑，見圖9。

圖9 紙片優加法聯合藥敏試驗示意圖

專家共識八：兩藥協同定義為抗菌藥物A和抗菌藥物B單藥均為耐藥，但抗菌藥物B在抗菌藥物A存在時表現為敏感或中介（即兩藥聯合的抑菌圈直徑明顯大于任何單藥抑菌圈直徑）。

7.4.3 改良紙片優加法 本方法與紙片優加法原理相似，目的為增加有效抗菌藥物的含量，達到加大劑量實現抑菌或殺菌的目的，如?？捎么朔ㄔ黾宇^孢哌酮-舒巴坦對CRAB的抗菌活性。操作方法同常規紙片擴散法，唯一的不同之處為多張同一抗菌藥物紙片緊鄰貼在一起，以實現該區域該抗菌藥物濃度加量的目的。由于舒巴坦對鮑曼不動桿菌存在殺菌活性，增加舒巴坦劑量可明顯提高鮑曼不動桿菌對頭孢哌酮-舒巴坦的敏感率[22]，可嘗試以頭孢哌酮-舒巴坦為基礎聯合舒巴坦的聯合藥敏試驗方案。見圖10。

圖10 改良紙片優加法[適用于鮑曼不動桿菌與頭孢哌酮-舒巴坦（2∶1） ]

7.4.4 肉湯紙片洗脫法 肉湯紙片洗脫法[32]為改良肉湯稀釋法，包括兩種方法。

①常規肉湯紙片洗脫法：此方法為兩種不同抗菌藥物的聯合。實驗時在4根無菌試管中分別加入2 mL的CAMHB肉湯，分別標記為C、A、B和A+B管，其中C管為生長對照，A管放入1張抗菌藥物A藥敏紙片，B管放入1張抗菌藥物B藥敏紙片，A+B管同時放入抗菌藥物A和抗菌藥物B藥敏紙片，輕輕渦旋 30 s，室溫（23±2）℃孵育至少30 min使紙片中的抗菌藥物完全擴散入肉湯中（不可超過60 min）（參考CLSI黏菌素肉湯紙片洗脫試驗）[35]。然后準備0.5麥氏濁度待測菌菌懸液，用移液器分別在在C、A、B和A+B管中加入10 μL的0.5麥氏濁度待測菌菌懸液，最終接種菌量為7.5×105CFU/mL，35℃孵育16～20 h后觀察各管中的細菌生長情況（圖11）。注意：本方法每試管中肉湯的體積需按每片藥敏紙片中所含抗菌藥物的量和該菌對該抗菌藥物的耐藥判斷標準而定，溶液中抗菌藥物最終濃度應≥中介標準。如該菌對抗菌藥物的耐藥標準為≥16 mg/L，藥敏紙片中所含抗菌藥物的量為30 μg/片，則每管中CAMHB肉湯的含量應為2 mL。以紙片中抗菌藥物完全溶解入肉湯中計算，2 mL肉湯中該抗菌藥物的濃度為15 mg/L（近似于耐藥標準）。

圖11 常規肉湯紙片洗脫法示意圖

專家共識九：若C、A和B管中細菌均生長，但A+B管無細菌生長，報告抗菌藥物A和抗菌藥物B聯合“存在協同作用”。

專家共識十：若C、A、B和A+B管中的細菌均生長，報告抗菌藥物A和抗菌藥物B“不存在協同作用”。

舉例：如該菌為產金屬酶肺炎克雷伯菌，抗菌藥物A所含藥物為頭孢他啶-阿維巴坦，抗菌藥物B所含藥物為氨曲南。結果顯示單藥時細菌均生長，但兩藥聯合后細菌生長被抑制，呈現協同抑菌或殺菌作用。

②改良肉湯紙片洗脫法：此方法為單種抗菌藥物增加劑量的試驗。實驗時在4根無菌試管中分別加入2 mL的CAMHB肉湯，分別標記為C、A、A×2和A×3，其中C管為生長對照，A管放入1張抗菌藥物A藥敏紙片，A×2管放入2張抗菌藥物A藥敏紙片，A×3管放入3張抗菌藥物A藥敏紙片，輕輕渦旋，室溫孵育至少30 min使紙片中的抗菌藥物完全擴散入肉湯中（不可超過60 min）（參考CLSI黏菌素肉湯紙片洗脫試驗）[35]。然后吸取10 μL 的0.5麥氏濁度待測菌菌懸液分別加入C、A、A×2和A×3管中，最終接種菌量為7.5×105CFU/mL，35℃孵育16～20 h后觀察各管中的細菌生長情況（圖12）。注意：本方法每試管中肉湯的體積需按每片藥敏紙片中所含抗菌藥物的量和該菌對該抗菌藥物的耐藥判斷標準而定，溶液中抗菌藥物最終濃度應≥中介標準。如該菌對抗菌藥物的耐藥標準為≥16 mg/L，藥敏紙片中所含抗菌藥物的量為30 μg/片，則每管中CAMHB肉湯的含量應為2 mL。以紙片中抗菌藥物完全溶解入肉湯中計算，2 mL肉湯中該抗菌藥物的濃度為15 mg/L（近似于耐藥標準）。

圖12 改良肉湯紙片洗脫法示意圖

專家共識十一：若C和A管細菌均生長，但A×2和A×3管細菌均未生長，報告抗菌藥物A增加劑量“存在協同作用”。

專家共識十二：若C、A、A×2和A×3管細菌均生長，報告抗菌藥物A增加劑量“無協同作用”。

7.5 聯合殺菌曲線[16-17， 24， 36-37]

通過檢測暴露于單藥或聯合藥物不同時間段時的細菌存活數，評估不同藥物間的協同或拮抗作用（圖13）。協同通常定義為：與最具抗菌活性的單藥相比，聯合用藥后細菌數呈≥2 log10CFU/mL級別的下降；拮抗通常定義為：與最具抗菌活性的單藥相比，聯合用藥后細菌數呈≥2 log10CFU/mL級別的上升。

圖13 兩藥聯合殺菌曲線示意圖

8 聯合藥敏試驗結果報告及相關注釋

不同聯合藥敏試驗方法所得結果，報告格式略有差異。

以出現協同作用為例，當采用金標準方法進行聯合藥敏試驗時，若抗菌藥物A和抗菌藥物B兩藥呈現協同作用，可報告：抗菌藥物A和抗菌藥物B聯合存在協同作用。當采用非金標準方法進行聯合藥敏試驗時，若抗菌藥物A和抗菌藥物B兩藥呈現協同作用，可報告：抗菌藥物A和抗菌藥物B聯合可能存在協同作用。

專家共識十三：采用肉湯微量稀釋棋盤法及紙條交叉法聯合藥敏試驗，可根據FIC指數判斷兩藥協同、相加、無關和拮抗結果。若采用其他方法開展聯合藥敏試驗，僅根據結果報告兩藥是否存在協同作用。見圖14、圖15。

圖14 聯合藥敏試驗結果報告格式參考圖示（肉湯微量稀釋棋盤法）

圖15 聯合藥敏試驗結果報告格式參考圖示（紙片洗脫法）

9 質量控制

目前國際上無專用的聯合藥敏試驗質量控制要求，建議可按照CLSI文件推薦的稀釋法（MIC測定）或紙片擴散法的質控要求[35]，規范聯合藥敏試驗所涉及的稀釋法和紙片擴散法等重要方法學的操作步驟、材料、試劑和質控菌株的要求進行質控，各實驗室宜根據自己實驗室的條件，針對所選擇的聯合藥敏方法進行質量控制或性能驗證，僅在所有涉及的聯合藥敏試驗環節均在控的前提下，方可開展聯合藥敏試驗。