水稻根系內生固氮菌的分離鑒定及其促生作用研究

董 萌，施龍清，解振興，連 玲，吳春珠，張居念，張數標，姜照偉

(福建省農業科學院 水稻研究所，福建 福州 350018)

氮素是水稻生長發育的重要營養元素，影響水稻的分蘗與穗質量，進而影響水稻產量，對水稻高產穩產有重要意義。我國水稻生產中，為保證產量而投入過多氮肥，導致氮肥利用率降低。國內外研究發現，水稻根系有大量微生物，其對提高水稻的氮肥利用效率具有重要作用[1-2]。在自然界中，生物固氮主要有自生固氮、共生固氮和聯合固氮3種方式，禾本科作物以聯合固氮菌為主。聯合固氮菌不僅能為宿主提供氮素，同時具有溶磷、增強宿主抗性、促進宿主生長發育的作用。

20世紀60年代，內生固氮菌首次在甘蔗中被發現，之后在不同禾本科作物中均有發現[3]。研究者利用PCR擴增方法，從日本水稻品種Nihonn的根系中檢測到23個含固氮酶鐵蛋白基因(nifH)序列的內生菌，其中Δ-變形菌(脫硫弧菌屬)和γ-變形菌(類克雷伯氏菌屬)是主要內生固氮菌[3]。Zhang等[2]對68份秈稻和27份粳稻根系微生物的測序分析發現，秈稻能特異富集與氮代謝相關的微生物，說明根系微生物群落可能會導致秈稻和粳稻氮素利用效率不同。硝酸鹽轉運蛋白基因(NRT1.1B)是秈稻氮利用效率高于粳稻的原因之一[4]。研究發現，不同發育時期、不同地點的水稻根系微生群屬不同[5-7]。水稻根系中的內生固氮菌可以產生吲哚乙酸(IAA)，IAA可促進根系生長，進而促進水稻根系對營養物質的吸收[8-9]。國內外研究人員從水稻根系中分離到許多內生固氮菌，但對不同生育期水稻根系內生固氮菌的多樣性及其對水稻根系生長和氮素吸收利用影響的研究較少。探究不同生育期水稻根系內生固氮菌的多樣性，可以揭示內生固氮菌在水稻體內的變化規律，為固氮菌在水稻生產上的應用提供理論依據。本試驗以水稻品種佳輻占為材料，在拔節期和抽穗期對其根系內生固氮菌進行分離鑒定，并對分離菌的溶磷能力、固氮酶活性和促生能力進行檢測，旨在為水稻微生物肥料的開發提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

水稻品種佳輻占、日本晴、臺粳8號，由本課題組提供。Ashby液體培養基和Ashby無氮固體培養基，購自青島海博生物。PCR反應所需試劑，均購自大連寶生物公司(TaKaRa)；膠回收試劑盒，購自美國OMEGA公司。無機磷固體培養基：葡萄糖10 g/L，硫酸銨0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸錳0.03 g/L，硫酸鉀0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，磷酸鈣5.0 g/L，瓊脂15 g/L。有機磷固體培養基：葡萄糖10 g/L，硫酸銨0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，氯化鉀0.3 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，硫酸亞鐵0.03 g/L，硫酸錳0.03 g/L，卵磷脂0.2 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，瓊脂15 g/L。解鉀培養基：葡萄糖10.0 g/L，磷酸鈉0.2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈉0.2 g/L，二水硫酸鈣0.2 g/L，碳酸鈣5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，鉀長石粉(直徑<74 μm) 2.5 g/L。

1.2 根系內生固氮菌株的分離

用于分離內生固氮菌的水稻品種為佳輻占，種植地點為福州市福建省農業科學院水稻研究所農場(119°21′57″E,26°00′53″N)。2019年3月15日育秧，4月19日采用人工插秧方式移栽。供試土壤類型為砂質壤土，試驗前土壤有機質、全氮含量分別為20.1和1.8 g/kg，速效氮、速效磷和速效鉀含量分別為144.91，31.72和188.17 mg/kg。氮肥(N)施用量為180 kg/hm2，施用比例為m(基肥)∶m(分蘗肥)∶m(促花肥)∶m(?；ǚ?=3∶4∶2∶1。在佳輻占拔節期(6月上旬)和抽穗期(6月下旬)各選5株水稻，取其根系(地下10 cm)用流水沖洗表面泥土，在超凈工作臺內用體積分數75%酒精浸泡10 min，然后用無菌水洗滌5次，放入20 g/L的次氯酸鈉溶液中消毒10 min，無菌水沖洗4～6次。將消毒后的水稻根置于含Luria-Bertani(LB)固體培養基的平板內，28 ℃培養2 d，若平板中無菌生長說明根表面消毒徹底，否則需要重新消毒。將表面消毒完全的根置于加有8 mL Ashby液體培養基的滅菌研缽內磨碎，靜置5 min后，取5 mL上清液加入到20 mL Ashby液體培養基中，28 ℃、180 r/min搖床培養2 d，隨后轉接到新的Ashby液體培養基中，轉接3次，然后在Ashby無氮固體培養基上反復劃線分離，直至出現單克隆菌落，挑取單克隆于2 mL無菌離心管中，加入1 mL Ashby液體培養基，28 ℃、180 r/min條件下搖床培養2 d，最后在LB固體培養基上劃線分離，挑取不同形態菌落純化培養并保存菌種。

1.3 根系內生固氮菌的鑒定與系統進化分析

在細菌編碼rRNA操縱子的5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA中，16S rRNA是最穩定保守的，常用于細菌的分類鑒定。合成16S rRNA基因引物：F27:5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，R1514:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。采用PCR方法對分離的細菌進行鑒定，PCR 反應體系(50 μL)為：5×Primer STAR GXL Buffer 10 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 4 μL，F27引物1 μL，R1514引物 1 μL，Template(菌液) 1 μL，PrimerSTAR GXL DNA Polymerase 2 μL，滅菌水31 μL。PCR擴增條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，68 ℃ 50 s，30個循環。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒回收目標片段，送上海生工生物股份有限公司測序。用NCBI blast對測序結果進行序列比對，采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，設定Bootstrap為1 000。

1.4 根系內生固氮菌溶磷解鉀能力測定

將分離的內生固氮菌菌株活化，吸取10 μL菌液置于無機磷固體培養基、有機磷固體培養基和解鉀培養基的平板中間，30 ℃培養48～72 h，觀察有無透明圈生成，重復3次。

1.5 根系內生固氮菌固氮酶活性檢測

利用乙炔還原法檢測內生固氮菌株的固氮酶活性。取5 mL活化后的菌液接種于Ashby液體培養基中，30 ℃培養2～4 d至對數生長期，在超凈工作臺內取5 mL新鮮菌液至頂空瓶中(已滅菌)并壓蓋封口。在實驗臺遠離火源處抽取1 mL氣體然后再注入1 mL標準乙炔氣體，30 ℃培養48 h后，80～100 ℃水浴5～10 min，用氣相色譜儀檢測生成乙烯體積分數。固氮酶活性以每單位樣品每小時生成乙烯的物質的量表示，計算公式如下：

固氮酶活性(nmol/(mL·h))=(生成乙烯濃度(μL/mL)×氣體體積(mL)×稀釋倍數×1 000)/(樣品體積(mL)×反應時間(h)×24.5) 。

1.6 根系內生固氮菌促生能力檢測

1.6.1 盆栽接種試驗 供試侵染水稻品種為日本晴，接種菌株為J3、J10、J23、H27、H30、H33、H37、H40-2，按照文獻[2]中的方法進行接種。具體操作如下：將水稻土裝入培養盆中，用密封袋封裝后置于60Co-γ輻照裝置中滅菌，輻照劑量為40 kGy(2 kGy/h，持續20 h)。去掉水稻種子谷殼，用體積分數75%乙醇表面滅菌1 min，然后再用10 g/L次氯酸鈉滅菌8 min，無菌水洗滌3～5次，在MS培養基上培養5 d。將菌株J3、J10、J23、H27、H30、H33、H37、H40-2分別用LB培養液培養至菌液OD600約為0.8，收集菌液并調整其OD600為0.5，備用。取2.0 mL混合菌液添加到250 mL無菌水中，并與培養盆中土壤(約200 g)混合，對照用無菌水替代。將5日齡的水稻苗轉移至培養盆中，在28 ℃、16 h光照和相對濕度40%條件下培養，2周后測量株高、地上部分鮮質量和根長、根鮮質量，評估菌株對水稻的促生作用。

1.6.2 田間接種試驗 供試侵染水稻品種為佳輻占和臺粳8號，種植地點在福建省農業科學院水稻研究所農場，2021年3月中旬育秧，30 d后插秧。將6株內生固氮菌株(J3、J23、H27、H33、H37、H40-2)分別培養至菌液OD600為0.5～0.6，收集菌液并用PBS (0.1 mmol/L,pH=7.2)緩沖液洗滌2次，調整細菌含量至108CFU/mL，等體積混合，備用。將混合菌液侵染水稻佳輻占、臺粳8號幼苗根部，15 min后移栽，對照組用緩沖液PBS浸泡根部，每個處理3個重復，水肥管理(除基肥外)按照2019年施肥方式減半。在水稻齊穗期，每小區選取10株水稻測定頂上3片葉(倒1葉、倒2葉和倒3葉)的SPAD值。

2 結果與分析

2.1 水稻根系內生固氮菌的分離純化

在水稻拔節期共分離得到10株固氮菌，分屬于5個科，其中腸桿菌科4株，假單胞菌科和莫拉菌科各2株，叢毛單胞菌科和柄桿菌科各1株(表1)。在水稻抽穗期分離到內生固氮菌20株，除1株科未定外，其余19株分屬于8個科，其中假單胞菌科7株，氣單胞菌科5株，腸桿菌科2株，叢毛單胞菌科、鞘脂單胞菌科、李斯特氏菌科、莫拉菌科和黃色假單胞菌科各1株(表2)。水稻2個生育期分離到的固氮菌多數屬于γ-變形菌綱。

表1 拔節期水稻根系內生固氮菌的分離鑒定結果

表2 抽穗期水稻根系內生固氮菌的分離鑒定結果

表2(續) Continued table 2

2.2 內生固氮菌16S rRNA基因測序與進化樹

由圖1可以看出，在水稻拔節期，根系內生固氮菌優勢菌屬為克雷伯氏菌屬，分離到的4株克雷伯氏菌株聚類到同一分支，與不動桿菌屬聚類關系最近，而與α-變形菌綱和β-變形菌綱的菌株聚類關系較遠。從圖2可以看到，水稻抽穗期分離得到的固氮菌分成2個大的分支，6個假單胞菌屬菌株(H28、H37、H40-2、H31-1、H33和H15)聚類在一起，然后與腸桿菌屬、泛菌屬和氣單胞菌屬的菌株聚類為一大分支；芽孢桿菌綱的H18，假單胞菌H42、H59，氣單胞菌H41、H47和H1-2聚為另一大分支。

圖1 拔節期水稻根系內生固氮菌的進化分析

圖2 抽穗期水稻根系內生固氮菌的進化分析

2.3 內生固氮菌株的溶磷解鉀能力及固氮能力

溶磷解鉀能力驗證結果發現，分離到的30株內生固氮菌中有7株菌具有溶解無機磷能力，分別是J3、J10、J23、H27、H30、H33和H37(圖3)；未發現具有解鉀能力的菌株。利用乙炔還原法鑒定除J57、J62、H15、H29-3、H30、H31-1、H43-3和H59外的22個內生固氮菌的固氮酶活性，結果表明分離的多數菌株固氮酶活性較低，為1.05～1.73 nmol/(mL·h)，其中H33和H40-2菌株固氮酶活性相對較高，分別為12.7和15.1 nmol/(mL·h)。

圖3 水稻根系內生固氮菌的溶磷能力

2.4 內生固氮菌株對水稻促生能力的影響

由圖4可以看出，接種內生固氮菌株組水稻幼苗的株高、地上部分鮮質量和根鮮質量均高于對照組，其中接種H40-2和J3菌株處理的差異達到顯著或者極顯著水平；內生固氮菌對根長影響不顯著。試驗結果表明，分離到的內生固氮菌對水稻幼苗有促生作用，尤其是H40-2和J3菌株。

*和**分別表示與對照相比，差異達顯著和極顯著水平。下同

由圖5可以看出，水稻幼苗經混合內生固氮菌侵染根部后，齊穗期臺粳8號倒1葉片、倒2葉片和倒3葉片SPAD值較對照顯著或極顯著增加，佳輻占各葉片SPAD值與對照無顯著差異，說明混合重組菌液處理后臺粳8號在齊穂期氮吸收利用率較對照更高。

L1.倒1葉；L2.倒2葉；L3.倒3葉

3 討 論

不同植物間、同種植物不同基因型和不同發育階段根系中微生物菌群均具有明顯的差異[10-14]。研究人員從水稻中鑒定了多種內生固氮菌，袁梅等[15]從水稻栽培品種中分離到19株內生固氮菌，隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、短桿菌屬(Brevibacterium)、Fictibacillus屬、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)；譚志遠等[16]從普通野生稻中分離到37株內生固氮菌，其中γ-變形菌綱腸桿菌科的克雷伯菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)是優勢菌屬。目前分離的內生固氮菌多數屬于δ-變形菌綱、γ-變形菌綱和α-變形菌綱[3,17-18]，其多樣性與水稻發育時期密切相關，δ-變形菌綱相對豐度隨著水稻生長發育的推進逐漸增加，而厚壁菌門、β-變形菌綱和γ-變形菌綱逐漸減少[7]。本研究從拔節期和抽穗期佳輻占中分離到30株內生固氮菌，均屬于變形菌門，隸屬于3綱9科12屬，其中假單胞菌科菌株最多，其次是腸桿菌科和氣單胞菌科，優勢菌屬與前人研究結果[16]一致。本研究發現，在水稻拔節期根系內生固氮菌以腸桿菌科為主，而抽穗期以假單胞菌科和氣單胞菌科為主，說明水稻內生固氮菌群多樣性會隨水稻的生長發育而發生變化[6]。

植物根際微生物及根內生微生物可以通過分泌植物激素、抑制病原菌或提高營養元素吸收效率來促進植物生長發育[8-9,19-21]，被稱為植物的“第二基因組”。擬南芥中，香豆素參與調控假單胞菌在根系的定殖，改善根系微生物群落組成，通過活化土壤鐵營養而促進植物對難溶性鐵的吸收利用[22-23]。水稻中分離的內生固氮菌同時具有一定的溶磷能力，從而可促進水稻幼苗的生長發育[8-9,24]。前人從水稻根際、稻田土壤中分離的固氮菌亦多為假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等，并證明其對水稻等作物具有較好的促生長作用，接種內生固氮菌菌株的水稻幼苗地上部分干質量與根干質量顯著提高[24-25]。本研究對佳輻占根系內生固氮菌進行分離鑒定，發現7株菌具有溶解無機磷的能力，并對水稻幼苗有促生作用，其中H40-2和J3菌株的促生作用最為明顯，這2個菌分別屬于假單胞菌屬和克雷伯氏菌屬，其促生機理有待進一步深入研究。

生物固氮可為植物提供氮源，是替代氮肥的一種潛力氮源[26-27]。固氮菌是理想的植物促生菌，近年來在甘蔗、玉米、水稻等作物中發現大量的內生固氮菌[18,28-32]，可為植物生長發育提供大量氮素從而減少氮肥的施用量。玉米的氣生根周圍也存在大量的固氮微生物，其通過固定空氣中的氮為玉米提供氮素，使玉米可以在低氮或不施氮肥的土壤中生長[32]。將根瘤固氮菌工程菌株PseudomonasprotegensPf-5 X940分別接種玉米和小麥，并用15N同位素示蹤，發現玉米和小麥從固氮菌中獲得了大量的氮素[33]。水稻超高產也與水稻根系微生物多樣性有關[34]。水稻氮素的積累與齊穂期頂上3片葉的葉綠素含量(SPAD值)呈顯著正相關，通過測定生育后期功能葉中的葉綠素含量可判斷氮素的利用率[35]。本研究結果表明，分離的內生固氮菌能使齊穂期臺粳8號倒1、倒2、倒3葉的SPAD值顯著提高，但對佳輻占葉片SPAD值無顯著影響，表明根內微生物群落可能會影響秈粳稻對氮素的利用效率，這與前人研究結果[2,4]一致。

4 結 論

從拔節期和抽穗期水稻根系中共獲得30株內生固氮菌，分屬于α、β、γ變形菌綱的多個科，內生固氮菌具有多樣性，且拔節期與抽穗期的多樣性不同。從佳輻占根內分離的內生固氮菌可以促進水稻幼苗生長，尤其是H40-2和J3菌株對幼苗促生作用明顯?；旌蟽壬痰娠@著提高齊穂期粳稻葉片SPAD值，表明混合菌液可以顯著提高水稻的氮吸收效率。