具有定向微孔結構的絲素蛋白導管用于周圍神經損傷修復研究與應用進展

萬紅霞，毛小曉，江津津，王歡，陳慶

（廣州城市職業學院食品科學與美食養生學院，廣東 廣州 510405）

神經系統損傷后的再生修復與功能重建一直是神經科學研究者亟待探索解決的重大課題。 與中樞神經［1］相比，外周神經結構更為簡單，且本身具有一定的再生能力，因此其被修復的潛力也更大。 當前，臨床上對于周圍神經缺損的治療方法主要分為以下幾類：對于短距離的神經缺損，采用顯微外科手術將離斷的神經對接后進行端對端外膜縫合，可以恢復神經功能；對于更為常見的長距離神經缺損（≥5mm），通常采用自體神經移植或異體神經移植進行治療。 自體移植是神經修復的“黃金標準”，具有理想的修復效果，但存在供區神經功能受損、取材長度受限、神經粘連、組織壞死等問題，無法滿足長距離的周圍神經缺損修復［2］。而同種異體神經移植雖然不受取材和距離的限制，卻存在倫理爭議和免疫排斥的問題［3］。 近年來，人工神經導管的出現為周圍神經缺損提供了較好的修復方法，其不受倫理和損傷距離的限制，是周圍神經修復的一種重要方式，目前越來越受到人們的關注［4］，具有廣闊的應用前景。

絲素蛋白（Silk fibroin，SF）作為一種用于構建人工神經導管的天然高分子材料，是經FDA 批準可植入體內的生物材料，它主要是從家養蠶絲中提取的，具有良好的生物相容性、機械性能且提取方便，免疫原性低，廉價安全，來源廣泛［5］。 過去幾十年絲素蛋白在周圍神經修復中發揮了重要的作用，這種材料可以滿足人工神經導管的抗扭結和耐縫合性等特點［6-7］。 而作為早在2001 年便開始應用的定向冷凍技術則使導管凝膠中所形成的微孔結構有沿冷凍溫度梯度方向的取向，使導管內壁具有定向排列的微孔，可以起到控制軸突生長分布的特點。 因此，本文對近年來有關具有定向微孔結構的絲素蛋白神經支架的制備方法與對周圍神經修復的作用進行分析，指出潛在的不足并對絲素蛋白神經導管的未來臨床應用進行展望。

一、絲素蛋白及其衍生物的生物學特性

絲素蛋白是一種從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，主要由輕鏈（26 kDa）和重鏈（390 kDa）組成，分子鏈中含有18 中氨基酸，其中大部分是甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸［8］。 在溶液中，絲素蛋白以無規則卷曲的構型為主，但在一定外界因素作用下如溫度、濃度、pH 值等，無規則卷曲會轉變為能量低且結構穩定的β-折疊構象［9］，這些結構使SF具有良好的機械性能和優異的生物相容性，可以與新生組織形成相匹配的速度進行降解，從而有利于組織再生和細胞外基質的沉淀。

研究表明，絲素蛋白具有以下幾個特性：（1）良好的生物相容性。 絲素蛋白作為一種天然高分子物質，具有良好的生物相容性。 Hu 等［10］通過靜電紡絲制備了一種絲素蛋白纖維支架，發現其能夠促進雪旺細胞的粘附、生長和增殖，具有良好的生物相容性。 （2） 有利于促進組織再生。 Wei等［11］使用分光光度法和掃描電子顯微鏡分析絲素蛋白結構和功能，首次在體外評估了絲素蛋白水凝膠神經導管對活細胞的活性、生長的影響，并通過動物實驗模型測定其是否具有增強神經再生的潛力，結果是積極樂觀的；Gu 等［12］使用由絲素和殼聚糖制備并經過雪旺細胞種植的人工神經導管修復周圍神經缺損，結果顯示該神經導管的再生修復效果接近自體神經移植，表明該神經導管具有良好的促進外周神經損傷后修復與再生的能力。 （3）孔隙率高和良好的生物降解性。 Meinel等［13］分別以絲素蛋白和膠原為原料制成軟骨修復支架，研究不同支架骨髓間充質干細胞（hMSC）黏附、增殖、代謝等行為的影響，研究發現hMSC 在緩慢降解的SF 支架上的黏附、增殖和代謝活性明顯優于在快速降解的膠原支架上，而且hMSC 在SF支架上成軟骨程度比膠原支架更高，這是因為SF支架具有高孔隙度、緩慢的生物降解和結構完整性的緣故。 （4）具有抗炎、抗氧化以及止血等性能。 Rodriguez-Nogales 等［14］構建了一種RGD 修飾的絲素納米顆粒（RGD-SFNs）用于炎癥性腸病的治療，結果顯示SFN 治療改善了結腸損傷，減少了中性粒細胞浸潤，改善了結腸受損的氧化狀態；RGD-SFNs 處理的大鼠顯著降低促炎細胞因子（IL-1β，IL-6 和IL-12）和誘導型一氧化氮合酶的表達，具有明顯的腸道抗炎特性。 Passi 等［15］通過實驗發現SF 納米顆?？梢杂行p少過氧化氫介導的氧化應激引起的ROS 水平升高；Wei 等［16］通過構建肝臟損傷的動物模型得出SF 可有效止血的結論。 總而言之，這些研究表明SF 蛋白具有良好的生物相容性和生物活性，在生物醫學領域具有廣闊的應用前景。

二、具有定向微孔絲素蛋白支架的制備方法

神經導管是由天然的或者人工合成材料制成的具有特定立體結構和生物活性的管狀結構，可將斷裂神經的遠端殘端和近端殘端連接起來，承擔橋接體的角色并起到引導神經生長的作用。 神經導管的結構在神經修復中發揮重要的作用，在神經導管中引入拓撲結構已經被證明具有良好的促進神經修復效果，目前對于神經導管的內部結構的設計多為模仿天然神經的束狀解剖結構，在神經導管內部構建定向的有序孔道，例如溝槽型結構、填充型結構、多通道型結構等，這些結構可以為細胞運動和遷移提供引導，促進雪旺細胞的黏附和增殖，有利于軸突的再生。 因此，在神經導管中引入具有方向性的拓撲結構被越來越多的研究者關注。

對于絲素蛋白基神經導管，通過梯度冷凍，冷凍干燥，顆粒瀝濾或氣體泡沫作用的方法均可使絲素溶液形成三維多孔的海綿狀支架［17］。 為了賦予絲素蛋白支架良好的定向微孔結構，在原來冷凍干燥方法的基礎上，利用定向冷凍的方法構建定向結構。 定向冷凍法目前已經被廣泛運用在仿生多孔結構材料和組織工程中，簡單來說，就是將混合溶液在固定的方向上進行冷凍，從而將溶質在晶層間沿著一定的方向生長多孔排列的結構，定向的微孔結構可以促進神經軸突朝著指定的方向進行生長，為神經再生提供拓撲結構引導。 定向冷凍技術能夠形成微通道結構，該結構能夠提供形貌和物理線索，可以較好地模擬神經內膜管的微通道。 Rao 等［18］使用定向梯度冷凍技術構建了具有沿中軸縱向排列孔道的導管。 Hibbitts等［19］開發出了一種快速冷卻冷凍工藝，使得所形成孔道的結構與排列最適合軸突的再生。

在定向冷凍技術中，通過溫度梯度提供定向效果較為常用。 梯度冷凍可以使導管凝膠中所形成的微孔結構有沿冷凍溫度梯度方向上的取向。這樣制備出來的基質具有大量排列整齊的微孔，這些微孔可以控制軸突的分布和定向生長。 具體技術過程是將金屬（不銹鋼或銅等）制成的板置于液氮中，再將裝有導管溶膠材料的模具置于金屬板上，這樣上下溫度不均一，形成了溫度上的梯度，導管溶膠中溶劑凍結的方向是單向的，冰晶將在特定的方向上生長，從而形成單向氣孔。 如Zhang 等［20］利用溫度梯度定向冷凍技術構建了具有定向多孔道結構的絲素蛋白支架，與無定向結構的絲素蛋白支架相比，具有定向多孔道結構的絲素蛋白支架能夠顯著促進海馬神經元軸突沿多孔道方向定向生長。 Asuncion 等［21］利用溫度梯度定向冷凍技術制備了絲素蛋白-明膠復合支架，發現BMSCs 在普通冷凍支架上散亂生長，而在定向冷凍支架上沿定向孔道生長。 Bhardwaj 等［22］以絲素蛋白作為原料，聯合梯度冷凍凝膠法制備了SF多孔結構的支架，研究結果發現與傳統的冷凍干燥法相比，該技術制備的支架具有分布更均衡、極性更強、連通性更優的微孔，且孔隙率可達90%。

三、具有定向微孔結構的絲素蛋白支架對神經細胞行為和功能的影響

（一）對神經元細胞黏附、遷移、增殖的影響

接觸引導理論認為，神經的連通性很大程度上取決于生長中的再生軸突朝向其真正目標的方向性。 如果再生軸突不能成功適當伸長，神經就不會成熟，導致其長期退化和功能喪失。 引導神經軸突延伸和神經元分化的一種有效方法是通過創建高度有序的微／納米結構表面形貌，在細胞水平上提供物理支持和引導。 先前很多研究表明，神經細胞能夠對許多取向結構產生響應，如通道和微溝槽形式的取向結構能夠顯著增強細胞排列和神經軸突生長。 Shula 等［23］使用定向冷凍法制備了具有單軸線性孔的神經引導支架，該支架可促進PC12 細胞神經軸突生長。 Zhang 等［24］制備了具有定向脊和負載生物活性分子的多通道／層粘連蛋白絲素支架，研究發現再生軸突在通道方向上以有組織和線性的方式分布。 這些研究表明，具有特殊定向通道的神經引導導管對于神經損傷修復中軸突的延伸具有重要意義。

神經修復支架的微孔尺寸也會對神經細胞的行為產生影響。 理論上，為引導軸突再生而創建的支架應該具有足夠小的孔，以物理對齊和限制軸突生長的方向，但又足夠大以允許血管形成和支持再生的細胞浸潤。 例如，Christopherson 等［25］發現納米拓撲結構的尺寸會影響神經元干細胞的分化；材料表面脊／溝圖案陣列可有效誘導人胚胎干細胞分化為神經元譜系，而無需使用任何分化誘導劑。 這可能是因為在拓撲結構引起的細胞形態變化期間，細胞骨架的伸長導致張力傳遞到細胞核，影響基因表達和信號轉導［26］。 此外，也有研究表明納米拓撲結構可以通過細胞骨架在細胞膜和核膜之間通過機械耦合使細胞核在納米尺度上變形，從而調節細胞行為［27］。 對于周圍神經修復用導管，基于神經的結構特點，僅僅提供定向通道或脊／溝模式是不夠的，具有特殊定向多通道的支架將具有更大的神經再生潛力。 有研究表明具有單向排列多孔微結構的絲素蛋白支架可以有效調節神經元細胞的行為，促進神經元分化［28］。

（二）對雪旺細胞成髓鞘的影響

雪旺細胞（SCs）在周圍神經損傷后的軸突再生和修復中起著重要作用。 有研究發現，負載神經營養因子和血管內皮生長因子的絲素蛋白支架能夠促進小鼠模型中SCs 的定向生長、增殖和擴散，以及周圍神經再生和新生血管形成［29］。 此外，用靜電紡絲法制備的具有定向纖維結構的絲素蛋白支架也被證實了可以有效促進雪旺細胞的粘附、增殖和遷移，并且能通過神經突形成復雜的神經網絡系統，從而幫助引導軸突的再生［30］。 Wang等［31］利用靜電紡絲技術構建了絲素蛋白／聚左旋乳酸己內酯納米纖維支架，研究其在4 周和8 周時對大鼠坐骨神經10 mm 缺損的修復效果，對再生神經進行電生理評估、組織學和免疫組織學分析，結果發現具有平行排列結構的納米纖維支架具有更好的再生神經功能恢復且再生神經更為成熟，雪旺細胞髓鞘化程度更高。

在病理生理學上，當周圍神經發生損傷時，軸突會出現損傷，雪旺細胞與遠端殘端失去了接觸而出現脫髓鞘。 此時，雪旺細胞會大量增殖并定向排列，成熟后的雪旺細胞膜作為髓鞘的組成部分，為軸突的再生提供空間，從而促進軸突的伸長。 有關背根神經節外植體的研究也發現，軸突的成熟與DRG 外植體中髓鞘的形成有關［32］。 絲素蛋白支架表面功能化各向異性微納拓撲結構可通過Apelin 通路進一步激活PI3K-Akt 和磷脂酰肌醇信號通路，通過級聯反應促進SCs 的增殖、分化以及促進SCs 的取向和DRG 的軸突延伸［33］。 這些研究均顯示，具有定向微孔結構的絲素蛋白支架在募集雪旺細胞，促進雪旺細胞成熟、成髓鞘方面具有優異的表現，表明了具有定向微孔結構的絲素蛋白神經導管在周圍神經修復領域上具有較好的應用潛力。

四、展望

綜上所述，絲素蛋白是一種制備神經導管的合適材料，能夠為周圍神經損傷修復提供優良橋接體。 但是，單一的絲素蛋白材料存在降解速度慢的問題，通過將絲素蛋白與其他天然高分子或者合成高分子材料復合可以調節絲素蛋白在體內的降解速度，使其與組織再生速度相匹配，所以將絲素蛋白與其他材料復合成為神經導管材料研究的熱門，如將絲素蛋白與膠原復合，構建膠原／絲素蛋白導管有望成為未來修復周圍神經損傷的理想人工神經導管。 同時，為了提高絲素蛋白支架的促神經再生能力，對絲素蛋白進行表面功能化修飾如RGD 修飾等，或負載神經細胞因子、富血小板血漿（PRP）、外泌體等，或者通過復合壓電材料、導電材料賦予絲素蛋白神經導管良好的電活性，這些方法都可以有效提升絲素蛋白神經導管的促周圍神經修復的能力。 此外，對于絲素蛋白基導管的內部結構的仿生化構建依然是一個研究的重點，選擇不同分子量和不同超微結構的絲素蛋白，利用定向梯度冷凍技術并聯合物質填充、納米纖維仿生技術、靜電紡絲技術、3D 打印技術等改善神經導管結構，最大限度還原組織再生的微結構，促進神經細胞黏附和定向遷移以及引導神經軸突定向生長，改善再生神經的功能，從而構建具有良好修復效果的功能化神經導管。 這樣的導管市場應用前景廣闊，可緩解我國神經修復材料嚴重不足和部分依賴歐美進口的局面。