新疆某醫院侵襲性念珠菌感染的菌種分布、藥物敏感性及耐藥基因初步分析

張松迪 王曉東 艾柯代·玉蘇甫 哈地利亞·哈斯木 帕麗達·阿布利孜

(新疆醫科大學第一附屬醫院皮膚科,烏魯木齊 830011)

隨著糖皮質激素、抗生素、介入性操作技術的廣泛應用以及老齡化、免疫受損人群數量增多,侵襲性真菌感染的發病率呈明顯上升趨勢。侵襲性念珠菌病是最常見的侵襲性真菌感染,死亡率達50%左右,已成為危重癥患者面臨的巨大威脅[1]。由于日漸廣泛的預防性和經驗性應用抗真菌藥,菌株的耐藥現象日趨嚴峻,特別是多重耐藥“超級真菌”耳念珠菌的出現已引起了全世界范圍的密切關注[2]。由于侵襲性念珠菌病的流行病學和耐藥情況存在地域差異,本文將調查分析本院侵襲性念珠菌感染分離菌株的流行分布情況以及耐藥特點,并在此基礎上探討真菌耐藥的分子機制,以期為當地侵襲性真菌病的臨床診治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源

收集2022年6月—2023年6月新疆醫科大學第一附屬醫院確診為侵襲性真菌病住院患者的無菌體液、分泌物、支氣管肺泡灌洗液、痰液等標本中的菌株,共計125株。剔除同一患者同一部位重復送檢的同種菌株以及首次培養陽性前一周內接受抗真菌治療患者的分離菌株。

1.2 設備與試劑

Sensititer YeastOne YO10真菌藥敏板(Thermo Fisher公司);Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒和聚合酶鏈反應試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;PCR引物的合成及產物雙向測序委托上海生工生物工程有限公司。PCR儀(美國ABI公司)、高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)、凝膠成像儀(上海復日科技有限公司)、電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 方法

菌種培養及鑒定 所有標本接種于顯色培養基(法國科瑪嘉)上并置于35 ℃培養箱中培養1～2 d,觀察菌落形態及顏色進行形態學鑒定,并對菌株核糖體DNA內轉錄間區( internal transcribed space,ITS)測序進行分子生物學鑒定。

抗真菌藥體外敏感性檢測 按照 Sensititer YeastOne YO10真菌藥敏板說明書進行操作,測定菌株對藥敏板上所包被的9種抗真菌藥(氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、卡泊芬凈、阿尼芬凈、米卡芬凈、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶)的最低抑菌濃度(minimal inhibit concentration,MIC)。藥敏結果依據美國臨床和實驗室標準化協會最新文件[3]的臨床折點(clinical breakpoints,CBPs)判讀,沒有臨床折點的參考流行病學界值(epidermiological cutoff values,ECVs)[4]來判讀。選擇近平滑念珠菌ATCC 22019、克柔念珠菌ATCC6258為質控菌株。

目的基因的提取、擴增和測序 按照Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒說明書對分離出的33株唑類耐藥念珠菌提取基因組DNA。依據GenBank數據庫中念珠菌ERG11基因序列(genBank accession no.NC_032093.1(白念珠菌);M23673.1 (熱帶念珠菌);L40389.1 (光滑念珠菌);AF531428.1(克柔念珠菌);NW_023503279.1(近平滑念珠菌)和NC_005967.2(光滑念珠菌)的PDR1基因設計引物來測序,引物序列見表1。

表1 PCR引物

(續表)

PCR反應總體系為25 μL：上下游引物各1 μL,dNTP(mix)1 μL,Taq酶0.2 μL,PCR緩沖液2.5 μL,ddH2O 18.3 μL。PCR產物經1%凝膠電泳觀察結果。PCR反應參數：①預變性：94 ℃ 5 min; ②擴增：94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸60 s,共35次循環擴增;③終延伸：72 ℃ 8 min;于4 ℃下保存。由上海生工生物工程有限公司對純化后的PCR產物采用Sanger法行雙向測序。利用SnapGene4.1.8軟件將擴增的產物基因序列與GenBank數據庫提供的基因序列進行比對以確定基因突變位點。

1.4 統計學分析

用SPSS 22和Origin2018軟件進行統計學分析和作圖。計數資料以頻數或構成比表示,采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗分析數據;P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 菌種鑒定及分布情況

送檢樣本經形態學和分子生物學鑒定后,共鑒定111株酵母菌,包括兩株少見酵母菌Wickerhamomycesonychis和Magnusiomycescapitatus以及109株念珠菌,其中最常見的是白念珠菌(56/111,50.45%),然后依次為光滑念珠菌(20/111,18.02%)、熱帶念珠菌(17/111,15.32%)和克柔念珠菌(8/111,7.21%),見圖1、2。菌株的體液標本來源主要來自于痰液(87,78.38%)、尿液(17,15.32%)、支氣管肺泡灌洗液(4,3.6%)。除了糞便和咽拭子之外,其他的體液標本中最常分離的前幾位菌種依次為白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌,見表2。分離的菌株主要來自13個科室,主要分布于呼吸科(41.44%)、重癥監護病房(ICU)(30.63%)和感染科(9.01%),見表3。

2.2 體外抗真菌藥物敏感性實驗結果

本研究僅對有CBPs和ECV以及例數≥3的菌株進行分析。多數念珠菌對兩性霉素B及5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-FC)高度敏感(見表4)。三種棘白菌素類藥物對常見念珠菌均表現出良好的體外抗真菌活性,其中白念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和葡萄牙念珠菌對所有的棘白菌素類藥物均敏感。熱帶念珠菌對阿尼芬凈和米卡芬凈的敏感率為100%(5.88%的菌株對卡泊芬凈表現為中介)。光滑念珠菌對阿尼芬凈、米卡芬凈、卡泊芬凈的敏感率分別為90%、90%和85%。此外,發現1株光滑念珠菌同時對3種棘白菌素類藥物耐藥(見表4)。

念珠菌對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑的耐藥率分別是7.1%、7.1%、3.6%、10.7%;光滑念珠菌對伏立康唑和泊沙康唑耐藥率較高(70%和45%),明顯高于氟康唑和伊曲康唑(5%);熱帶念珠菌對泊沙康唑的耐藥率最高(64.71%),對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐藥率分別為23.53%、11.76%和17.65%?？巳崮钪榫鷮蝾愃幬锏哪退幝蕿?2.5%(氟康唑除外)。葡萄牙念珠菌對所有唑類藥物均敏感,近平滑念珠菌對泊沙康唑和伊曲康唑100%敏感,對氟康唑和伏立康唑的耐藥率分別是33.33%和0(對伏立康唑有33.3%表現為中介),見表5。本研究中共發現33株念珠菌(6株白念珠菌、14株光滑念珠菌、11株熱帶念珠菌、1株克柔念珠菌和1株近平滑念珠菌)為唑類耐藥/非野生株。

2.3 目的基因測序結果

對33株唑類耐藥或非野生型念珠菌菌株所提取的目的基因進行PCR擴增均獲得了大小與DNA Marker位置相符并且無非特異性產物的條帶。將上述菌株的ERG11和PDR1基因測序結果分別進行blast比對,將起始密碼子ATG中的A計作1來確定突變位點。

圖1 菌種鑒定情況：A.念珠菌鈣熒光白染色鏡下形態(×400),①～④：白念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔念珠菌;B.念珠菌科瑪嘉顯色培養基鑒定,a～d分別為克柔念珠菌、光滑念珠菌、白念珠菌、熱帶念珠菌;C.部分念珠菌ITS區基因PCR擴增瓊脂糖凝膠電泳圖

ERG11基因測序結果顯示6株白念珠菌共發現兩處錯義突變(E266D 和(V488I);在11株熱帶念珠菌中僅有1株發生錯義突變(Y132F和S154F),還有8株發生同義突變,另外2株未發生突變;14株光滑念珠菌中有兩株發生錯義突變,分別為K108N和T293I,其余菌株均發生同義突變;而在克柔念珠菌和近平滑念珠菌中未發現錯義突變。14株光滑念珠菌中PDR1基因共發現7處錯義突變(D243N、S76P、V91I、L98S、T143P、F948S、K425R),見表6。

圖2 菌株分布情況

表2 菌株標本類型分布

表3 菌株科室分布

3 討 論

近年來侵襲性念珠菌病的發病率逐漸上升,但治療侵襲性真菌感染的藥物種類有限,耐藥菌株的出現常引起治療失敗而給臨床帶來了極大挑戰[5]。隨著抗真菌藥物的廣泛應用,侵襲性念珠菌病的致病菌種分布有一定變異和地區差異,非白念珠菌感染比例逐漸增高,在某些地區甚至已經超過了白念珠菌[6]。本研究收集的侵襲性念珠菌病菌種以白念珠菌為主,與我國兩項大型多中心研究[7-8]結果一致。非白念珠菌以光滑念珠菌和熱帶念珠菌的分離率最高,與國外部分研究報道[9-10]一致。我國一些單中心研究[11-14]顯示非白念珠菌的優勢菌種是光滑念珠菌,但在一些大樣本的多中心研究[15-17]中最常分離的非白念珠菌是近平滑念珠菌,可見致病菌種的分布存在一定的地域差異,可能與菌株分離標本的來源及種類、不同的患病人群以及抗真菌藥物的選擇應用等多種因素有關,這提示我們有必要對當地侵襲性念珠菌的流行病學進行動態監測。

表4 常見念珠菌對棘白菌素、5-氟胞嘧啶和兩性霉素B的體外藥敏結果

表5 常見念珠菌對唑類的體外藥敏結果

表6 唑類耐藥/非野生型念珠菌中相關基因突變

從菌株分布科室來看,本研究收集的菌株主要分布于呼吸科、ICU和感染科,這可能因為這些科室患者病情相對復雜和危重,廣譜抗生素的應用率較高以及侵入性操作技術和侵襲性生命支持的應用相對較多,導致機體微生態紊亂、菌群失調、免疫屏障破壞進而增加了條件致病菌感染的機率。在臨床工作中我們應對這些科室重點關注、早期識別易感的高危人群,完善相應的防治措施。

本研究體外抗真菌藥物敏感性實驗數據顯示念珠菌整體對兩性霉素B和5-FC高度敏感,對唑類藥物表現出不同程度的耐藥。白念珠菌對唑類藥物較為敏感(敏感率89.29%～92.86%),非白念珠菌對唑類藥物的敏感性相對較低,如光滑念珠菌對伏立康唑、熱帶念珠菌對泊沙康唑的耐藥率高達64.7%和70%,這與目前國內外研究[18-19]報道的耐藥流行趨勢相一致,與其他種類的念珠菌相比,光滑念珠菌和熱帶念珠菌對唑類藥物具有天然的異質耐藥性,更易發生唑類耐藥。棘白菌素類藥物因其對唑類耐藥念珠菌具有良好的抗菌活性和獨特的抗菌機制在臨床上應用逐漸增多,目前棘白菌素類藥物被推薦作為治療侵襲性念珠菌病的一線治療藥物[20-21],值得關注的是近年來棘白菌素類藥物的耐藥現象正在逐漸增多,可能是隨著藥物的廣泛應用而帶來的選擇性壓力有關,耐藥現象在光滑念珠菌中尤為顯著。國內外學者均報道了光滑念珠菌對棘白菌素類藥物的耐藥現象[9,22],美國的一項研究發現[23]光滑念珠菌對棘白菌素耐藥率超過了10%。本研究結果(見表4)顯示,棘白菌素類藥物對多數念珠菌具有良好的抗菌活性,但光滑念珠菌對棘白菌素的耐藥率達5%～10%。雖然棘白菌素類藥物在我國普及稍晚,其耐藥現象在臨床上并不常見,但發生光滑念珠菌感染時我們仍需密切關注藥敏情況并注意用藥選擇。

唑類抗真菌藥因經濟、相對安全有效在臨床上應用最為廣泛,念珠菌對唑類藥物的耐藥現象也最為常見,探索其耐藥機理有助于推進侵襲性念珠菌病的治療方案的選擇和改善患者預后。ERG11基因[24-25]編碼真菌細胞膜麥角甾醇合成途徑關鍵酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶,該酶是唑類藥物的作用靶點,ERG11基因突變可導致靶酶構象改變、影響藥物和靶酶的結合而導致耐藥。念珠菌的唑類耐藥機制常與ERG11基因突變有關[24],然而光滑念珠菌對唑類耐藥機制主要與鋅簇轉錄因子編碼基因PDR1突變有關,PDR1基因突變可上調外排泵編碼基因CDR1、CDR2及SNQ2而導致唑類耐藥[26-27]。本研究共收集33株唑類耐藥/非野生型念珠菌,這些菌株的ERG11基因測序結果示白念珠菌共發現16處突變位點,其中3處發生錯義突變(D116E、E266D和V488I)。這些錯義突變雖然常見于唑類耐藥株中,但已有研究[28]發現這些突變與耐藥無關,這也證實了菌株中還存在其他的耐藥機制;耐藥熱帶念珠菌ERG11基因共發現7處突變位點,其中2處發生Y132F和S154F錯義突變,這兩個位點位于基因突變熱點區域內,已經研究[29-30]證實可導致唑類耐藥;光滑念珠菌ERG11基因中發現了兩處錯義突變(K108N和T293I),目前ERG11基因突變尚未被報道作為一種重要的機制參與光滑念珠菌唑類耐藥,關于此機制的研究報道數量有限,本研究中新發現的變異位點是否與耐藥相關還有待進一步驗證。另外,本研究在14株耐藥光滑念珠菌中均檢測到PDR1錯義突變,其中S76P、V91I 、L98S、 T143P、D243N突變經證實可導致外排泵編碼基因CDR1或CDR2的表達上調而發生唑類耐藥[31-32];K425R、F948S為新發現的突變,新的變異位點還需進一步研究來證實是否與耐藥相關。

綜上所述,我院侵襲性念珠菌病的主要致病菌是白念珠菌,侵襲性念珠菌病致病菌種對棘白菌素類藥物、兩性霉素B、5-FC較為敏感,非白念珠菌特別是熱帶念珠菌和光滑念珠菌的唑類耐藥率較高,我們需謹慎合理地選擇抗菌藥物、及時行動態藥敏監測及對致病菌種進行流行病學特征分析。本研究在唑類耐藥/非野生型的白念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的ERG11基因和PDR1基因發現了可介導唑類耐藥的錯義突變,由于念珠菌耐藥機制錯綜復雜,本研究中未發生突變、存在同義突變以及經證實發生的突變與耐藥無關的耐藥株中是否還存在其他的耐藥機制仍需深入和持續性的研究來明確。未來應繼續收集更多的樣本,對可能與耐藥相關的錯義突變運用軟件對ERG11蛋白質同源分子建模分析預測突變位點的功能,還可構建耐藥突變位點異位表達的菌株來檢測耐藥表型以進一步證實基因突變位點與耐藥的關系,并對PDR1調控的下游基因轉錄水平進行分析以驗證PDR1基因突變對耐藥的影響。此外,可進一步結合樣本的臨床特征、危險因素、預后結局等來進行綜合分析,為我院侵襲性念珠菌病的診治提供更詳盡的科學依據。