永春醋來源微生物篩選及多樣性分析

謝喜珍 林風 李志強 鄭秋霞 吳麗云

謝喜珍，林風，李志強，等.永春醋來源微生物篩選及多樣性分析［J］.福建農業科技，2023，54（12）：15-26.

收稿日期：2023-10-05

作者簡介：謝喜珍，女，1990年生，研究實習員，碩士，主要從事應用微生物學研究。

*通信作者：吳麗云，女，1966年生，博士，教授級高級工程師，主要從事發酵工程研究（E-mail：lywu66717@163.com）

基金項目：福建省科技計劃公益類項目（2021R1005002、2023R1005008）。

摘? 要：永春老醋發酵過程微生物菌落變化對其品質形成及工藝優化具有重要意義。對永春老醋發酵過程樣品進行微生物篩選、形態學鑒定及分子生物學初步鑒定，共篩選出107株菌株，鑒定多為芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌。利用高通量測序技術對樣品進行細菌與真菌多樣性分析，不同水平下分析微生物群落結構，在細菌菌落組成中，YCV1（醋母）、YCV4（2.5年陳醋）組成相似，YCV2（8個月陳醋）、YCV3（3年陳醋）、YCV5（1.5年陳醋）組成相似，YCZ1（糟床1）、YCZ2（糟床2）組成相似，HYQ1（黑衣曲）與其他樣品差異較大；真菌菌落組成分析中，YCV2與YCV3組成相似，YCV4、YCV5兩者較為相似與YCZ2一定程度相似，YCV1、HYQ1及YCZ1與其他樣品相差大。不同樣品真菌與細菌菌落結構差異大。該研究結果為永春醋發酵過程的理論研究及工業化生產提供科學依據，也可為后期永春醋藥食同源開發奠定基礎。

關鍵詞：永春老醋；分離純化；細菌多樣性；真菌多樣性

中圖分類號：Q 93??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：0253-2301（2023）12-0015-12

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.003

Microbial Screening and Diversity Analysis of Yongchun Aged Vinegar

XIE Xi-zhen， LIN Feng， LI Zhi-qiang， ZHENG Qiu-xia， WU Li-yun*

（Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou， Fujian 350007， China）

Abstract： The changes of microbial community in the fermentation process of Yongchun aged vinegar are of great significance to its quality formation and process optimization. In this paper， the microbial screening， morphological identification and molecular biology preliminary identification were carried out on the fermentation samples of Yongchun aged vinegar. A total of 107 strains were screened， and most of them were identified as Bacillus， Acetobacterium Balch， lactic acid bacteria， Saccharomyces and Aspergillus. The high-throughput sequencing technology was used to analyze the bacterial and fungal diversity of the samples， and the microbial community structure was analyzed at different levels. In the composition of bacterial colonies， YCV1 （mother of vinegar） and YCV4 （2.5 years vinegar） were similar in composition， YCV2 （8 months vinegar）， YCV3 （3 years vinegar） and YCV5 （1.5 years vinegar） were similar in composition， and YCZ1 （bed 1） and YCZ2 （bed 2） were similar in composition. HYQ1 （Heiyiqu） was significantly different from other samples. In the compositional analysis of fungal colonies， YCV2 and YCV3 were similar in composition， YCV4 and YCV5 were similar to YCZ2 to a certain extent， and YCV1， HYQ1 and YCZ1 were significantly different from other samples. The structure of fungal and bacterial colonies varied greatly in different samples. The research results provided scientific basis for the theoretical research and industrial production of Yongchun vinegar fermentation process， and could also lay a foundation for the later medicine-food homologous development of Yongchun vinegar.

Key words： Yongchun agaed vinegar； Separation and purification； Bacterial diversity； Fungal diversity

食醋作為日常生活中常見的調味料，有著悠久的歷史文化。據現代科學研究表明食醋具有緩解疲勞、增強食欲、促進消化、促進血液循環、平衡血液酸堿度、改善肝功能等保健功效，深受大眾青睞，是中國藥食同源文化研究的最佳切入點［1-5］。隨著人民生活水平的提高以及研發技術的革新，人們對食品的需求已從溫飽上升到營養、保健類，醋類產品的開發從僅局限于食醋調味品拓展到以各種水果或果汁為原料生產果醋，既保留水果的風味營養，又改善口感，深受大眾喜愛［6］。無論是食醋還是果醋，其核心都是醋酸菌發酵產酸［7-9］。永春老醋以紅曲、芝麻、糯米為原料，采用液態發酵方式，經糯米浸泡蒸煮、酒精發酵、液態醋酸發酵、陳釀等多道工序釀造而成，呈棕褐色，口感柔和帶甜味，因其獨特性質，與鎮江香醋、四川保寧醋、山西陳醋并稱為四大名醋［10］。由于地理環境及釀造工藝的差異，不同種類食醋的口感，微生物種類、豐富度、多樣性都存在較大差異［11-12］。

醋的發酵和陳釀的過程同時也是微生物通過富集、繁殖成穩定的菌落結構的過程，這些微生物菌落對食醋的營養和風味至關重要［13］。本研究擬對實驗室所采集的來源于福建永春老醋不同生產過程的樣品，進行微生物篩選、分離、菌種鑒定，并對永春老醋不同發酵過程中微生物多樣性進行菌群分析［14-18］，以期獲得永春老醋不同階段具有優勢作用的微生物群落組成，為探索不同階段微生物菌落組成對永春老醋釀造及風味影響提供科學依據，為永春醋藥食同源研究奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 試劑與儀器

主要試劑：RBA、MRS干粉培養基購于北京陸橋技術股份有限公司；瓊脂糖購于Genetech 公司；OMEGA Gel Extraction kit購于OMEGA公司；2×Taq PCR MasterMix購于TIANGEN公司、5000 bp DNA Ladder Marker購于TaKaRa公司；其他試劑均為國產分析純。

主要儀器：高壓蒸汽滅菌鍋（GR110DR型，Zealway），超凈工作臺（SW-CJ-FB，江蘇蘇凈集團有限公司），pH計（FE20K型，METTLER TOLEDO），水浴鍋（DK-2000-111L型，黃驊菲斯福實驗儀器有限公司），電熱鼓風干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）、振蕩培養箱（ZQZY-CF8型，上海知楚儀器有限公司），PCR儀（CF-16RX，Thermo Fisher公司），凝膠成像系統（JS-680型，上海培清科技有限公司），旋渦振蕩器（VORTEX3，IKA），光學顯微鏡（DM2000型，Leica），分析天平（BSA223S型，Sartorius）。

1.2? 試驗材料

YCV1為醋母樣品、YCV2為8個月陳醋樣品、YCV3為3年陳醋樣品、YCV4為2.5年陳醋樣品、YCV5為1.5年陳醋樣品、YCZ1為糟床樣品1、YCZ2糟床樣品2、HYQ1為黑衣曲樣品，以上分離樣品均取樣于福建永春老醋有限責任公司。

1.3? 培養基配制

PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g，加適量蒸餾水煮沸0.5 h，紗布過濾，加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂，定容至1000 mL，121℃滅菌30 min。

PCA培養基：胰蛋白胨5.0 g、酵母膏2.5 g、葡萄糖 1.0 g、瓊脂15 g，調pH至7.0±0.2，定容至1000 mL，121℃滅菌30 min。

NA培養基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15 g，調pH至7.3±0.2，定容至1000 mL，121℃滅菌30 min。

RBA培養基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖 10.0 g、碳酸二氫鉀1.0 g、無水硫酸鎂 0.5 g、孟加拉紅0.033 g、氯霉素 0.1 g，瓊脂20 g，定容至1000 mL，121℃滅菌30 min。

1.4? 試驗方法

1.4.1? 樣品分離純化? 采用稀釋涂布法分離樣品，在無菌條件下，將8個樣品原液用無菌生理鹽水稀釋到不同濃度梯度（10-6～10-1），取適量稀釋后樣品分別涂布于PCA培養基及MRS培養基，37℃培養數日；涂布于RBA培養基，25℃培養數日，待菌落長出，用接種環挑取單菌落至相應培養基平板再次分離純化。

1.4.2? 菌株的形態學鑒定? 觀察菌株的菌落形態，進行結晶紫草酸銨染色，在油鏡下觀察菌落形態并記錄，根據菌落形態的不同，初步判定是否為單菌落，并分別分類保存。

1.4.3? 菌株的分子生物學鑒定? 將初篩、分離純化得到的菌株，接種于液體培養基培養2～4 d，分別采用TIANGEN公司的細菌、真菌基因組DNA試劑盒提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，采用16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′），ITS通用引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3），PCR擴增得到目的序列，經瓊脂糖凝膠電泳觀察目的條帶與預期一致，送測，比對，鑒定。PCR擴增體系為2×Taq PCR MasterMix 25 μL、兩端引物各0.5 μL、基因組DNA 5 μL、純水補充體積至50 μL；擴增程序為，94℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，35個循環；72℃延伸5 min；10℃保存。將PCR擴增產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，16S rRNA序列目的條帶大小約1500 bp，ITS目的條帶大小約600 bp，產物送福州鉑尚測序有限公司測序。測序序列在美國國家生物信息技術中心（NCBI）數據庫進行比對。

1.4.4? 永春醋來源樣品微生物多樣性分析? 采用Illumina Miseq 平臺對永春老醋不同發酵過程中具有代表性的8個樣品進行高通量測序，利用生物學軟件對樣品進行多樣性分析［19-20］。利用 Uclust 軟件，以97%為閾值進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）劃分，進而實現樣品序列的聚類，利用Mothur v 1.30.1軟件對相似水平大于97% 的OTUs進行細菌和真菌的α-多樣性分析，包含Chao1、Coverage指數、Observed species、PD whole tree、Shannon、Simpson指數，進而評估永春醋來源不同樣品微生物群落的豐富度和多樣性。通過R語言及作圖軟件分析對物種進行Venn 圖和細菌、真菌的群落組成成分分析，層級聚類分析，從而對永春醋來源不同樣品的微生物進行β-多樣性分析。

2? 結果與分析

2.1? 永春醋來源微生物菌株分離及形態學鑒定結果

本試驗樣品來源于永春老醋不同生產發酵過程，選擇具有代表性的8種樣品，利用不同篩選培養基初篩，經分離純化，共篩選菌株107株。通過結晶紫染色、微生物形態學觀察主要篩選得到的菌株有芽孢桿菌、桿菌、酵母菌等。部分樣品鏡檢圖片見圖1。

2.2? 永春醋來源微生物菌株分子生物學鑒定結果

本批次共培養107株菌，3株經多次嘗試未能提取基因組，11株測序后峰圖出現雜峰、套峰等原因不可用。在分類學上，當2個分類單元間的序列同源性大于97.5%，可認為屬于同一個種，若同源性低于97.5%的菌株需要結合形態學表型鑒定。經鑒定芽孢桿菌占比43.52%、醋酸桿菌占比12.04%、乳酸菌占比11.11%、酵母菌占比9.35%、霉菌占比3.71%。

2.3? 永春老醋來源樣品α-多樣性分析

由表1可知，來源于永春醋不同生產發酵過程的8個樣品Coverage指數都大于0.99，說明物種測序深度已基本覆蓋到樣品中幾乎所有物種，較接近物種的實際情況。Chao1表示群落中預估的物種數量，而Observed-species表示所能觀察到的物種數量，在細菌多樣性指數檢測結果中，HYQ1和YCV4的Chao1指數、Observed-species指數較高，表明物種豐富度越大，YCV2最低，物種豐富度較低；PD-whole-tree是依據系統發育樹而來的一種多樣性指標，數值越大，群落多樣性越高，在8個樣品中差別較大，其中YCV4最大，HYQ1次之，YCV2最??；Shannon指數來源于信息熵，是信息理論的測量數值，用來度量群落豐富度，其中HYQ1數值最大，YCV3最??；Simpson指數越大，說明群落多樣性較豐富，其中HYQ1數值最大，YCV1和YCV5次之，YCV3最小，其他樣品之間差距較小。

就真菌的α-多樣性而言，YCV2的chao1指數最大，YCV5次之，YCV1最??；在8個樣品中Observed-species中YCV5最大、YCV2次之，同樣YCV1最小，說明YCV2和YCV5物種數量較多，YCV1的物種豐富度低；PD-whole-tree值和Shannon值都是YCV5最大，YCV2次之，YCV1最??；Simpson指數YCV2、YCV3較大、YCV1最小。綜上在α-多樣性指數中，真菌的多樣性與細菌多樣性差距較大，永春醋來源樣品中HYQ1、YCV4細菌物種豐富度較高，而在真菌中YCV2、YCV5豐富度較高，說明在黑衣曲樣品和發酵2.5年的陳醋中細菌為優勢菌群，而在YCV2和YCV5中真菌多樣性較豐富，說明在陳釀8個月及1.5年的樣品中，真菌為優勢菌群。

2.4? 永春老醋來源樣品的物種Venn圖分析

將永春醋不同發酵階段樣品按類分組，YCV1～YCV5取樣均勻混合，糟床樣品YCZ1、YCZ2混合均勻，如圖2-a 所示細菌的OTU數量圖中，永春醋樣品YCV、糟床樣品YCZ、黑衣曲樣品HYQ中共有OTU數585個。3個樣品共有OTU數156個，YCV與YCZ共有238個OTU，YCZ和HYQ共有197個OTU，YCV和HYQ共有 212個OTU，單獨存在于YCV、YCZ、HYQ的OTU各有161、36、53個，說明3個樣品在一定程度上物種組成存在相似，相似中又有不同，都有各自獨特的物種；在真菌的OTU 數量圖2-b中，3個階段樣品共有OTU數902個，3個樣品中共有的OTU數185個，YCV與YCZ共有273個OTU，YCZ和HYQ共有228個OTU，YCV和HYQ共有 227個OTU，單獨存在于YCV、YCZ、HYQ的OTU各有484、33、527個，圖中可得YCV即永春醋不同發酵及陳釀階段的群落結構較為豐富，菌株數量較多。

2.5? 永春醋來源樣品細菌群落結構分析

在門水平下研究細菌群落結構組成，由圖3可知，YCV1、YCV4、 YCZ1、YCZ2中變形菌門為主，分別占比81.81%、82.43%、83.73%、79.83%；YCV2、YCV3、YCV5主要是厚壁菌門為主，分別占比99.42%、97.40%、92.85%；HYQ1以厚壁菌門及變形菌門為主，各占54.28%、43.41%。變形菌門的成員廣泛包括嚴格厭氧、嚴格需氧、兼性厭氧菌等，大多數變形菌門屬于兼性厭氧型，而在醋酸發酵階段以屬于α-變形菌綱的好氧菌為主，在食醋的醋酸發酵階段需要好氧菌發揮重要作用，能將乙醇等醇類物質及糖類轉化為有機酸；而厚壁菌門多為厭氧菌，且厚壁菌門多數可產芽孢，能在極端及脫水環境下生存。芽孢桿菌多為兼性厭氧型，能分解一些糖類及蛋白質，為醋酸發酵階段做鋪墊，此外還可加快四甲基吡嗪的生成，四甲基吡嗪具有擴張血管、抗血栓、抗血小板凝集、改善微循環等作用，可為永春醋藥食同源后續研究提供支持。永春醋發酵及貯存過程是一系列復雜微生物共同作用的結果，醋酸發酵階段及貯存期間高酸環境為芽孢、醋酸菌、乳酸菌等一系列菌的生長創造條件。在永春醋不同發酵及貯藏階段，其細菌菌落變化存在波動和差異。

在屬水平下研究細菌群落結構組成，由圖4可知，YCV1主要含相對豐富度67.77%醋酸桿菌科的駒形桿菌、4.84%的乳酸菌、3.13%的芽孢桿菌以及其他多種少量豐富度的菌落結構； YCV4、YCV1中以駒形氏桿菌為主，相對豐富度各為67.77%、81.03%；YCV2、YCV3、YCV5以乳酸桿菌屬為主，各占98.98%、96.29%、92.64%；YCZ1、YCZ2在屬水平上組成幾近相似，以醋酸桿菌為主，各占82.63%、78.69%；HYQ1則含有相對豐富度為44.87%的芽孢桿菌、32.19%的伯克霍爾德氏菌、9.25%的乳酸菌、8.34%的醋酸菌及其他種類微生物。在永春醋的醋酸發酵階段及貯藏初期，變形菌門的醋酸桿菌及厚壁菌門的乳酸菌為主要活躍菌落組分。醋酸桿菌在其發酵產酸過程發揮重要作用，可加快乙酸生成。食醋中的不揮發酸，也是關乎食醋質量的重要指標，其中的乳酸便由乳酸菌發酵而來，乳酸菌亦可提升老醋中乳酸含量。除此之外，多數樣品含有多種相對豐富度較低的其他微生物，菌落組成豐富而復雜，也從側面反映永春醋發酵過程是多種微生物共同作用的結果。

綜上，從不同水平分析永春醋來源8個樣品的細菌群落結構，在屬水平分析微生物菌落組成則剖析的越細致。YCV1、YCV4、YCZ1、YCZ2所含的細菌群落主要是變形菌門、α-變形菌綱、醋酸桿菌目，其中YCV1、YCV4在屬水平主要群落結構為駒形氏桿菌，而YCZ1、YCZ2中多數是醋酸桿菌。YCV2、YCV3、YCV5細菌群落結構主要來源于厚壁菌門、芽孢桿菌綱、乳酸桿菌目、乳酸桿菌屬。HYQ1含有厚壁菌門又含有變形菌門的微生物、芽孢桿菌綱和變形菌綱、芽孢桿菌目和伯克氏菌目、芽孢桿菌屬和伯克霍爾德氏菌。YCV1（醋母）是8個樣品中細菌群落組成最為豐富的，醋母顧名思義“醋酸發酵之母”，醋酸發酵是在醋酸菌的作用下，將酒精氧化產酸的過程［21］，可見醋母在醋酸發酵過程的重要作用。在細菌群落結構中，8個樣品并無呈現明顯的菌落變化規律，在發酵及陳釀期，細菌結構以醋酸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌為主。醋酸桿菌在永春醋的醋酸發酵階段將醇類物質轉化為有機酸，賦予永春醋特殊的口感，且能氧化糖類、糖醇、有機酸等物質，具有保健功效。乳酸菌代謝過程生成多種氨基酸、有機酸、礦物質、微量元素、酶等，對永春醋風味形成、改善以及營養價值的提升至關重要。芽孢桿菌為兼性厭氧型菌，芽孢桿菌所含的一些酶能將部分糖及蛋白質水解成葡萄糖單糖及小分子多肽。永春老醋之所以成為老醋，是因為自然轉酸時間長，雖然現代工藝可大大縮短發酵時間，但為了更好地傳承永春醋工藝及風味，傳統工藝還是被諸多釀造者延續用至今。

2.6? 永春醋來源樣品真菌群落結構分析

在門水平下研究真菌群落結構組成，圖5可知子囊菌門除了在YCZ1中相對豐富度占比最低僅65.73%，在其他樣品中相對豐富度均大于85%。子囊菌門作為真菌界最重要的門，種類繁多，其所屬的寄生的子囊菌廣泛應用于釀造行業，在本批次永春醋來源不同樣品中處于優勢菌群，說明其對永春醋發酵過程中起到舉足輕重的作用。

在屬水平下研究真菌群落結構組成，由圖6可知，YCV1中不確定分類的屬相對豐富度占97.87%；YCV2和YCV3以不明分類的屬及酵母菌為主；YCV4和YCV5以酵母菌屬為主要菌群，各占82.89%、54.58%，其中YCV5中還含有多種微量的菌群共同起作用；YCZ1枝孢菌屬占39.83%、不確定分類屬占18.38%、曲霉屬占18.13%、節擔菌屬占17.84%以及微量的其他分類菌屬；YCZ2中酵母菌屬相對豐富度占38.70%、曲霉菌占24.39%、梅奇酵母科占9.34%、枝孢菌科占8.2 6%、不確定分類占7.04%；HYQ1中曲霉屬占56%、紅曲霉屬占33.72%，其余多為其他種類的菌落。屬水平分析不同樣品真菌群落結構可知出不確定屬的分類外，以酵母菌、曲霉屬居多。在食醋釀造過程，酵母菌與所含糖類成分經過一系列復雜的反應生成醇類物質，大部分醇類物質氧化生成酸，部分醇與酸在酵母、霉菌和細菌所產生的脂酶的作用下，發生酯化反應生成脂類物質，食醋中脂類物質種類繁多，營養豐富，這一系列有趣的反應形成特殊的成分造就了永春醋特殊的風味。屬水平上比較各樣品真菌與細菌群落結構多樣性，YCV1和HYQ1細菌群落結構比真菌群落結構多樣復雜，除此之外，其他樣品中普遍存在真菌的群落結構多樣性大于細菌群落結構多樣性。

綜上，在不同水平分析永春醋來源8個樣品的真菌群落結構可知，來源于永春醋不同生產階段的8個樣品，真菌的菌落結構較細菌菌落結構更為復雜多變，說明在永春發酵及貯存階段，真菌為主導力量。YCV1主要是來源于子囊菌門、糞殼菌綱、不確定分類的目、屬一類的微生物；YCV2和YCV3主要是來源于不確定分類屬、酵母屬、曲霉屬等微生物；YCV4和YCV5真菌組成較為相似，主要來源于子囊菌門、酵母屬的微生物；YCZ1主要是枝孢菌屬、曲霉屬、節擔菌屬、不確定分類的屬；YCZ2主要是酵母菌屬、曲霉屬的微生物；HYQ1則是曲霉屬和紅曲霉屬。在永春醋貯存及發酵階段，霉菌雖相對豐富度不高，但其所代謝產生特殊風味物質，對永春醋品質的提升有極大的促進作用。

2.7? 永春醋來源不同樣品β-多樣性分析

2.7.1? PCA分析? 圖7、圖8為來源于永春醋不同生產過程樣品的真菌及細菌PCA分析圖，圖中獲悉在細菌的PCA分析圖中YCV1和YCV4在二維坐標上距離最接近，組成更為相似；同理，YCV2、YCV5及YCV3這3個樣品距離較近，組成較為相似，YCZ1與YCZ2組成相似，HYQ1與其他樣品差距都較大；而在真菌的PCA圖中不同樣品的差異較大，YCV1與其他物種差距較大，YCV2與YCV3組成較相似，YCV4與YCV5組成相似，YCZ1與YCZ2雖都來源于糟床樣品，且他們在細菌主成分分析上較為相似，但真菌的菌落結構匯總差異較大，HYQ1相比于其他樣品，群落結構組成差距大。該分析結果與前述中真菌、細菌中，在不同水平下菌落結構圖的結果是吻合的。

2.7.2? PCoA分析? 圖9、圖10為來源于永春醋不同生產過程樣品的真菌及細菌PCoA分析圖，不同樣品間的群落結構組成越相似，這些樣品在坐標上越傾向于聚集在一起，當群落組成結構差異性較大時，樣品則會分開散落。YCV1和YCV4在二維坐標上距離最接近，組成更為相似；同理，YCV2、YCV5及YCV33個樣品組成較為相似，YCZ1與YCZ2組成相似，HYQ1與其他樣品差距都較大；而在真菌的PCoA圖中不同樣品的差異較大，YCV1與其他物種差距較大，YCV2與YCV3組成較相似，YCV4與YCV5組成相似，YCZ1與YCZ2雖都來源于糟床樣品，且他們在細菌主成分分析上較為相似，但真菌的菌落結構匯總差異較大，HYQ1相比于其他樣品，群落結構組成差距大。該分析結果與前述中真菌、細菌中在不同水平下菌落結構圖及PCA的分析的結果是吻合的。

2.7.3? PLS-DA分析? 由圖11、圖12可知，本試驗中來源于永春醋不同過程的8個樣品，在真菌和細菌多樣性中差距較大，來源于YCV1-YCV5這5個永春醋不同發酵及貯藏階段的樣品，菌落結構存在波動但又較為相似；YCZ1和YCZ2是來源于不同糟床上的樣品，兩者較為相似；HYQ1無論在真菌或者細菌的PLS-DA分析中與其余樣品相比存在較大差異。

2.7.4? 聚類分析? 由圖13可知，細菌的樹狀圖中各個樣品間都存在一定程度的差異，YCV1與YCV4優先聚類，兩樣品間距離為0.26606；YCV2與YCV5優先聚類后再和YCV3聚類，YCV2與YCV5距離為0.14144；YCV2與YCV3距離0.27241，YCV5與YCV3距離0.40624，YCZ1與YCZ2優先聚類，兩樣品間距離為0.0544；HYQ1與其他樣品距離都在0.98以上，說明HYQ1與其他樣品細菌菌落結構差異大。

由圖14可知，真菌的樹狀圖各樣品間相比細菌的菌落組成差異性更大，YCV2與YCV3優先聚類，距離0.11741；YCV4與YCV5優先聚類后與YCZ2聚類，YCV4與YCV5距離0.40082，YCV4與YCZ2距離0.71899，YCV5與YCZ2距離0.67567，HYQ1與其他樣品真菌菌落組成差異大，距離在0.77356以上；YCZ1與其他樣品真菌菌落組成差異大，距離在0.82169以上。同一個樣品的真菌和細菌菌落組成差異大，YCV1細菌菌落和YCV4相近0.26606，但在真菌菌落組成中兩者差異大，距離達0.97715；YCZ1與YCZ2在細菌菌落相似樹狀圖組成相近，距離為0.0544，而在真菌樹狀圖中并沒有優先聚類，距離達0.82169。

綜上可得，本批次永春醋不同生產過程樣品，真菌的菌落相似性高于細菌的，菌落組成更為豐富。YCV1、YCV2、YCV3、YCV4、YCV5為陳醋發酵及不同陳釀時間段的樣品，這些樣品細菌的菌落組成結構較為相近，說明在永春醋發酵階段及貯存陳釀早期時間，醋液中細菌菌菌落的變化大于細菌菌落變化，隨著貯存時間的延長，真菌菌落多樣性更為豐富，真菌菌落的變化對永春老醋風味的形成至關重要，而在 YCZ1、YCZ2、HYQ1中真菌群落變化大于細菌菌落變化。

3? 結論與討論

本研究利用不同菌株對不同培養基的偏好性，對采集于永春老醋有限公司不同生產過程的8個樣品進行微生物篩選，并對篩選所得部分菌株進行形態學分析及分子生物學初步鑒定，共篩選107株菌株，通過結晶紫染色、形態學觀察，所篩選的菌株大部分為桿狀菌、芽孢桿菌、酵母菌。采用試劑盒提取基因組DNA，利用聚合酶鏈式反應進行16S rDNA或ITS鑒定，將PCR產物測序，序列在NCBI進行同源性分析可得篩選菌株多為芽孢桿菌屬、醋酸桿菌、乳酸菌、酵母菌、霉菌。

利用Illumina Miseq 高通量測序技術對高通量測序，對永春醋來源不同樣品微生物進行多樣性分析。對相似水平大于97%的操作分類單元進行α-多樣性分析，包括Chao1指數、Coverage指數、Observed species、PD whole tree、Shannon、以此來評估微生物多樣性及豐富程度，發現不同樣品真菌和細菌的物種豐富度及多樣性差距較大，HYQ1（黑衣曲樣品）、YCV4（2.5年陳醋）細菌物種豐富度較高，而在真菌中YCV2（8個月陳醋）、YCV5（1.5年陳醋）豐富度較高，說明在黑衣曲樣品和發酵2.5年的陳醋中細菌為優勢菌群，而在YCV2和YCV5中真菌多樣性較豐富，說明在陳釀8個月及1.5年的樣品中，真菌為優勢菌群。對不同樣品分組做Venn圖分析，YCV組群落結構較糟床樣品及黑衣曲樣品更為豐富。對永春醋不同發酵過程中的不同樣品進行微生物群落結構分析，可得不同樣品都存在個體差異，越往深一級水平探究菌落組成結構，剖析的越細致。在細菌菌落組成YCV1（醋母）、YCV4（2.5年陳醋）相似，以駒形氏桿菌為主；YCV2（8個月陳醋）、YCV3（3年陳醋）、YCV5（1.5年陳醋）以乳酸桿菌屬為主，YCZ1（糟床1）、YCZ2（糟床2）中多數是醋酸桿菌，HYQ1（黑衣曲）以芽孢桿菌屬和伯克霍爾德氏菌為主要菌落。真菌菌落組成較為復雜，不同樣品差異大，YCV1以不確定分類的屬為主；YCV2、YCV3真菌組成相似，以不確定分類屬、酵母屬、曲霉屬等微生物為主；YCV4和YCV5真菌組成較為相似，酵母菌為優勢菌群；YCZ1以枝孢菌屬、曲霉屬、節擔菌屬、不確定分類的屬為主；YCZ2以酵母菌屬、曲霉屬為主；HYQ1以曲霉屬和紅曲霉屬為主。

對永春醋來源樣品進行真菌及細菌的PCA（聚類分析）、主坐標分析（PCoA）、相似度聚類樹分析，其分析結果與微生物菌落結構組成分析是想吻合的。利用樹狀圖直觀反映多個樣品之間的相似和差異程度，圖中可得不同樣品細菌與真菌的菌落結構差別較大，在細菌樹狀圖清晰可見YCV1與YCV4優先聚類，YCV2與YCV5優先聚類后再和YCV3聚類，YCZ1與YCZ2優先聚類，HYQ1與其他樣品相比差異明顯；而在真菌樹狀圖中YCV2與YCV3優先聚類，YCV4與YCV5優先聚類后與YCZ2聚類，YCV1、HYQ1及YCZ1與其他樣品相比差距較大。

永春老醋發酵是一個非常復雜、需要多種微生物共同參與的過程，老醋富含18種22氨基酸及多種對人體有益的發酵微生物，營養價值較高，對永春醋發酵過程中的不同樣品微生物群落結構研究，可探究永春醋獨特風味的來源，同時為傳統釀造食醋的科學研究和工業化生產提供相關理論基礎，以及為新型功能性食醋的開發提供理論參考。

永春老醋憑借其精湛的工藝，在品質、食用和藥用等有著獨特的競爭優勢，除去腥調味等作用，永春老醋具有降血脂［22］、降血壓、緩解疲勞、提高食欲、軟化血管等功效［23-24］，其特有的紅曲成分對心腦血管疾病具有一定的防治作用［25］。本研究對永春醋不同生產階段微生物的篩選及初步鑒定為課題組菌種保藏庫注入新的活力，永春老醋作為國家地理標志產品，歷史悠久，發酵中所涉及菌群經世代馴化已極具當地特色［26］，對其微生物多樣性分析，為永春醋發酵過程的理論研究及工業化生產提供科學依據，今后的研究工作將對所篩選的優勢菌株做進一步的生理生化鑒定，模擬應用至發酵工藝，研究其是否能對發酵過程產生有利影響，如縮短發酵周期、提高產量等，為優化生產工藝及和控制質量提供更多的可能，推動福建永春老醋產業的高質量發展。

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（責任編輯：柯文輝）