球等鞭金藻CRY1與COP1互作及生物信息學分析

李歡 李龍玉 鐘潔 陳由強 余雪冰 何文錦 陳建楠

李歡，李龍玉，鐘潔，等.球等鞭金藻CRY1與COP1互作及生物信息學分析［J］.福建農業科技，2023，54（12）：07-14.

收稿日期：2023-11-02

作者簡介：李歡，女，1999年生，碩士，主要從事分子生物學研究。

*通信作者：陳建楠，男，1991年生，碩士，實驗師，主要從事三角褐指藻培育研究（E-mail：381220681@qq.com）。

基金項目：福建省自然科學基金項目（2023J01509）。

摘? 要：為驗證球等鞭金藻的隱花色素蛋白IgCRY1與下游蛋白IgCOP1是否互作，通過提取球等鞭金藻的總RNA反轉錄成cDNA為模板，擴增目的片段，構建BD-IgCRY1和AD-IgCOP1載體，共同轉入AH109酵母菌株進行酵母雙雜驗證，并對IgCOP1蛋白進行生物信息學分析。結果顯示：從球等鞭金藻中克隆到IgCRY1和IgCOP1的CDS序列分別為1560 bp和1185 bp。通過酵母雙雜驗證了IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白相互互作。對互作蛋白IgCOP1進行生物信息學分析，發現該蛋白的分子量大小為43.7 kDa，編碼的氨基酸個數為394個，二級結構62.69%為不規則卷曲，是典型的親水性蛋白。系統發育樹分析顯示IgCOP1蛋白聚于分支底部，與其他分支的親緣關系較遠。IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白相互互作的驗證，為球等鞭金藻的光信號調控生物學過程提供了重要的理論基礎。

關鍵詞：球等鞭金藻；酵母雙雜；IgCRY1蛋白；IgCOP1蛋白；生物信息學分析

中圖分類號：Q 943.2? ???文獻標志碼：A? ???文章編號：0253-2301（2023）12-0007-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.002

Interaction and Bioinformatics Analysis of CRY1 and COP1 in Isochrysis Galbana

LI Huan1，2，3，4， LI Long-yu1，2，3，4， ZHONG Jie1，2，3，4， CHE You-qiang1，2，3，4，YU Xue-bing1，2，3，4， HE Wen-jin1，2，3，4， CHEN Jian-nan1，2，3，4*

（1. College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China; 2. Public Service

Platform for Industrialization Development Technology of Marine Biological Medicine and Products，

Fuzhou， Fujian 350117， China; 3. Fujian Key Laboratory of Special Marine Bioresource Sustainable

Utilization， Fuzhou， Fujian 350117， China; 4. Fuzhou Institute of Marine Research， Marine Active

Substances and Products Technology R & D Center， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： In order to verify whether the cryptochrome protein IgCRY1 of Isochrysis galbana interacted with the downstream protein IgCOP1， the total RNA of Isochrysis galbana was extracted and reverse transcribed into cDNA as a template to amplify the target fragment. The BD-IgCRY1 and AD-IgCOP1 vectors were constructed and co-transfected into the yeast strain AH109 for the yeast two-hybrid verification. And the bioinformatics analysis of IgCOP1 protein was performed. The results showed that the CDS sequences of IgCRY1 and IgCOP1 cloned from Isochrysis galbana were 1560 bp and 1185 bp， respectively. The mutual interaction between IgCRY1 protein and IgCOP1 protein was verified by the yeast two-hybrid system. The bioinformatics analysis of the interacting protein IgCOP1 revealed that the molecular size of the protein was 43.7 kDa， and the number of encoded amino acids was 394， which was a typical hydrophilic protein with 62.69% of its secondary structure irregularly coiled. The phylogenetic tree analysis showed that IgCOP1 protein was clustered at the bottom of the branch， and had a distant relationship with the other branches. The verification of the interactions between IgCRY1 protein and IgCOP1 protein provided an important theoretical basis for the biological process of light signal regulation in Isochrysis galbana.

Key words： Isochrysis galbana； Yeast two-hybrid； IgCRY1 protein； IgCOP1 protein； Bioinformatics analysis

球等鞭金藻是等鞭金藻科，等鞭金藻屬的海洋微藻［1］，適合生長在溫度為22℃、光照強度為75 μmol·m-2·s-1、pH 偏堿性的環境中［2］。這種微藻的生長速度快、易于培養、個體較小且無細胞壁［3-4］，這些特點使得它在實驗室研究和大規模生產中都極具吸引力。球等鞭金藻富含大量的色素、不飽和脂肪酸等營養物質，這些成分對人體健康有很多益處，如抗氧化、降低膽固醇等，因此被廣泛應用于食品、保健品和生物醫藥等領域。

隱花色素（Cryptochrome，Cry）是一種重要的藍光受體，它能夠吸收藍光和近紫外光，也能參與植物下胚軸及莖節的伸長過程，還對開花及生物鐘的光敏調控起到關鍵作用［5］。自1979年被Gressel首次發現以來，Cry在不同領域的研究一直備受關注［6］。在植物中，藍光會抑制莖節間和下胚軸的伸長，對光形態建成和開花調控具有顯著的影響［7-8］。為了更好地理解這一現象，學者們對隱花色素的組成進行了深入研究，發現主要由CRY1、CRY2和CRY3三大成員組成，其中，CRY1是參與藍光調控光形態發生過程的主要成分，而CRY2則與光周期調控開花時間有關，CRY3則主要負責損傷修復作用［9］。在真核微藻中，隱花色素也廣泛存在。例如，紅藻［9］、等鞭藻［10］和萊茵衣藻［11］等藻類都含有隱花色素。研究發現，在藍光條件下，萊茵衣藻中CRY蛋白的缺失會對類胡蘿卜素的合成以及光合系統的調控產生影響［12-13］，這一發現提供了更多關于隱花色素在微藻中的功能和作用機制的線索。

CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1（COP1）在植物學領域中具有舉足輕重的地位，它是第一個被克隆的光形態建成核心調控因子［14-15］。光受體通過感知不同的波長，將外界信號傳遞給COP1，COP1再調控下游相關的基因和轉錄因子的表達［16］。在藍光條件下，COP1的功能受到一定的抑制，這種抑制作用有助于穩定CO，進一步促進植物的開花過程［17-22］。值得注意的是，COP1會與CRY1直接相互作用，共同調控植物的光形態建成，這一互作關系提供了更多關于光響應機制的深入理解。

為了進一步研究球等鞭金藻在光響應過程中的機制，本研究利用酵母雙雜驗證藍光受體蛋白IgCRY1與IgCOP1蛋白之間是否相互互作，同時結合生物信息學分析IgCOP1蛋白的相關信息，進一步全面地了解COP1在藻類中的功能和作用機制，從而為藻類的光信號轉導機制提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

球等鞭金藻Isochrysisgalbana來自福建省特色海洋生物資源可持續利用重點實驗室，高保真限制酶、EcoR I和BamH I、質粒小量提取試劑盒、PCR產物純化回收試劑盒均購買自北京全式金生物公司，AH109酵母感受態細胞及所贈送的Trans1-T1感受態細胞購買于上海唯地生物公司，pGADT7（AD）載體和pGBKT7（BD）載體由本實驗室保存。目的條帶所擴增的引物合成及菌落PCR驗證測序由擎科生物公司完成。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 球等鞭金藻總RNA提取與反轉錄? 用北京全式金RNA提取試劑盒（Q20629）提取生長至藻細胞數約為1×108個的球等鞭金藻總RNA，參照說明書。對于球等鞭金藻總RNA的反轉錄參照北京全式金反轉錄試劑盒（Q20415）。

1.2.2? BD-IgCRY1和AD-IgCOP1載體的構建? 利用北京全式金生物公司的同源重組試劑盒（CU201-03），設計在帶有酶切位點EcoR I和BamH I的pGBKT7載體同源臂引物，見表1，以球等鞭金藻的cDNA擴增目的片段，按說明書將克隆好的IgCRY1基因序列無縫克隆到pGBKT7載體上，IgCOP1基因序列無縫克隆到pGADT7載體上，轉化至大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，分別用卡那霉素（100 mg·mL-1）和氨芐卡那霉素（100 mg·mL-1）的LB培養基37℃過夜培養。挑取單克隆進行菌落PCR驗證，驗證正確的克隆進行送公司測序比對。

1.2.3? BD-IgCRY1載體自激活和毒性檢測? 將測序正確的 BD-IgCRY1質粒和空載BD質粒分別轉化至AH109酵母感受態中。通過比較長在色氨酸缺陷型平板上的菌落情況來判斷BD-IgCRY1是否對 AH109 有細胞毒性作用，其中以含有空載BD 的菌為對照。并將含有BD-IgCRY1的酵母菌分別涂布于色氨酸缺陷、色氨酸缺陷加X-α-Gal以及色氨酸缺陷加X-α-Gal和AbA的平板上。觀察菌落是否變藍，來判斷BD-IgCRY1是否存在自激活現象。其中X-α-Gal的濃度為20 mg·mL-1，AbA的濃度為500 μg·mL-1。

1.2.4? 酵母雙雜驗證IgCRY1和IgCOP1的互作? 將測序正確的BD-IgCRY1和AD-IgCOP1質粒共同轉入酵母菌株AH109中，涂布SD/-Leu/-Trp、SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養基上培養。將AD空載和BD空載共轉以及BD-IgCRY1與AD空載共轉的酵母菌株作為陰性對照。

1.2.5? 生物信息學分析? 利用從擬南芥數據庫TAIR（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp） 得到已知COP1蛋白序列，在球等鞭金藻的基因組數據庫進行Blast P比對搜索篩選候選蛋白質。球等鞭金藻COP1蛋白質的分子量和等電點通過ExPASy（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）進行預測。應用SWISS-MODEl（https：//swissmodel.expasy.org/）在線網站及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi？NORMAL=1）網站預測IgCOP1蛋白的三級結構及結構域，并用Hydrophobicity ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/pscale/Hphob.Sweet.html）在線網站預測IgCOP1蛋白質的疏水性，最后使用 MEGA7.0 軟件對球等鞭金藻和其他物種的蛋白質序列進行比對并構建系統發育樹。

2? 結果與分析

2.1? 球等鞭金藻總RNA的提取? 本試驗提取生長至對數期的球等鞭金藻總RNA。用2%瓊脂糖電泳檢測，有3條完整的條帶（圖1）。用核酸蛋白儀檢測其濃度為560

ng·μL-1，純度OD260/OD280的比值為2.0。

2.2? BD-IgCRY1和AD-IgCOP1基因全長的克隆

以球等鞭金藻cDNA為模板，擴增IgCRY1和IgCOP1基因全長，其中IgCRY1為1560 bp，IgCOP1為1185 bp。用1%瓊脂糖凝膠電泳進行跑膠檢測，見圖2。

2.3? 誘餌蛋白BD-IgCRY1細胞毒性檢測

含BD-IgCRY1的酵母菌是否對AH109酵母細胞有毒性，結果見圖3，發現與陰性對照組相比并無差別，因此BD-IgCRY1對酵母AH109無毒性。

2.4? 誘餌蛋白BD-IgCRY1自激活檢測

含有BD-IgCRY1的酵母菌AH109分別涂布于色氨酸缺陷、色氨酸缺陷加X-α-Gal以及色氨酸缺陷加X-α-Gal和AbA的平板上，由圖4可知，酵母菌在組氨酸缺陷加X-α-Gal平板能夠生長并且呈藍色，說明 BD-IgCRY1存在自激活現象。加上500 μg·mL-1的AbA發現BD-IgCRY1能正常生長且沒有變藍，說明該濃度下能夠抑制BD-IgCRY1的自激活現象。

2.5? 球等鞭金藻IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白的互作驗證

由圖5可知，AD-IgCOP1與BD-IgCRY1共轉化的菌株、AD空載與BD-IgCRY1載體共轉和AD與BD空載共轉在色氨酸、亮氨酸缺陷型的平板上均能正常生長，說明都成功共同轉入酵母菌株中。其中AD-IgCOP1與BD-IgCRY1共轉化的菌株在組氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤缺陷型平板上也能正常生長，并且能使組氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤缺陷型平板加X-α-Gal和AbA的培養基變藍（圖6）。但BD- IgCRY1與AD空載體、AD與BD空載共轉的菌在組氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤缺陷性平板以及加X-α-Gal和AbA的平板上均無法生長。說明了 IgCRY1蛋白和IgCOP1蛋白可以發生相互互作。

2.6? 球等鞭金藻IgCOP1蛋白的生物信息學分析

2.6.1? IgCOP1蛋白一級結構、二級結構的分析? 通過ExPaSy在線網站對IgCOP1進行一級結構的分析，結果顯示，該蛋白的分子量大小為43.7 kDa，編碼的氨基酸個數為394個，等電點為4.77，為酸性蛋白。IgCOP1蛋白的不穩定系數為44.09，略大于40時，為不穩定蛋白［11］。

為了進一步研究IgCOP1蛋白，其二級結構見表2，不規則卷曲是IgCOP1的主要組成部分，占比為62.69%，而α-螺旋為7.61%，延伸鏈結構為29.7%，無β-螺旋結構（圖7）。

2.6.2? IgCOP1三級結構及蛋白保守結構域分析? 對IgCOP1進行三級結構的預測建模見圖8。對IgCOP1蛋白的保守結構域分析應用SMART在線網站，由圖8可知，IgCOP1蛋白序列的保守結構域為第80～370位是WD40結構域。

2.6.3? 疏水性分析? 利用Hydrophobicity ProtScale軟件預測IgCOP1蛋白質的疏水性。由圖10可知，IgCOP1蛋白質疏水性最小為-3.179，最大值為1.367，并通過ProtParam軟件IgCOP1蛋白進行親疏水性分析，分析結果顯示其親水性平均系數為-0.544，是典型的親水蛋白。

2.6.4? IgCOP1系統發育樹分析? 通過NCBI下載不同物種中與IgCOP1同源性較高的氨基酸序列并進行多序列比對，與擬南芥、歐洲油菜、銀杏、蕓薹、豌豆、花生、水稻、大葉藻、布氏輪藻、蔭平鲉、條紋斑竹鯊的COP1蛋白序列進行建樹，由圖11可知，根據系統進化樹的分支情況，得到球等鞭金藻的COP1蛋白處于單獨一個分支。說明球等鞭金藻的COP1蛋白與其他物種發揮不同的功能。

3? 討論與結論

隱花色素作為一類藍紫光受體，在植物和藻類中參與了多種生理過程，并對環境刺激做出適應性反應。有研究表明，藍光能夠促進球等鞭金藻巖藻黃素和DHA含量的積累［23-24］。此外，藍光對其他藻類的生理特性也有著重要的影響。例如，在三角褐指藻中，短時間的藍光刺激培養同樣會增加巖藻黃素和不飽和脂肪酸物質的積累［25］；在壇紫菜中，藍光能促進果孢子和殼孢子的萌發體顏色加深轉變為鮮紅色［26］。這些研究揭示了藍光在調節藻類生長和發育中的重要作用。

為了深入研究球等鞭金藻在光下的信號轉導機制，本研究首先從該藻中成功克隆了1560 bp和1185 bp的CDS片段，構建了BD-IgCRY1和AD-IgCOP1載體，通過酵母雙雜驗證了IgCRY1與IgCOP1之間存在顯著的互作關系，生物信息學分析IgCOP1蛋白編碼394個氨基酸，二級結構為62.69%的不規則卷曲，是典型的親水蛋白。球等鞭金藻中IgCOP1蛋白與其他物種的COP1蛋白在結構上存在一定的差異。在模式植物擬南芥中，COP1蛋白包含了WD-40、RING finger和Coiled-coil3個結構域［27］。而本研究發現，球等鞭金藻的COP1蛋白僅包含WD40結構域，因此系統發育樹分析得到COP1與其他物種的親緣關系較遠，這表明該蛋白在演化過程中可能發生了一些適應性的變化。

綜上所述，本研究不僅揭示了球等鞭金藻中CRY1和COP1蛋白之間的相互作用關系，并對IgCOP1蛋白進行理性分析。為了解CRY1和COP1在藻類中的光信號轉導機制提供理論基礎，并為未來的應用研究提供有價值的參考。

參考文獻：

［1］王珺，王永強，陳雪芬，等.金藻0898培養的生態條件研究［J］.海南大學學報（自然科學版），2008（1）：93-98.

［2］吳電云，鄒寧，常林，等.球等鞭金藻（Isochrysis galbana parke）的培養研究進展及應用前景［J］.科技信息，2010，（33）：28-29.

［3］胡鴻鈞，呂頌輝，劉惠榮.等鞭金藻屬（等鞭金藻目）1新種——湛江等鞭金藻（Isochrysis zhanjiangensis sp.nov）及其超微結構的觀察［J］.海洋學報（中文版），2007，（1）：111-119.

［4］毛連菊，張從堯，由學策.湛江等鞭金藻的超微結構研究［J］.大連水產學院學報，1999（4）：7-12.

［5］ANGELIQUE D F，ALESSANDRA R，MAURIZIO R D A，et al.Exploring the molecular basis of responses to light in marine diatoms［J］.Journal of experimental botany，2012，63（4）：1575-1591.

［6］EDMUNDS L N.Blue-Light Photoreception in the Inhibition and Synchronization of Growth and Transport in the Yeast Saccharomyces［J］.Springer Berlin Heidelberg，1980，30（1）：749-754.

［7］劉玉兵，陳海燕，王軍偉，等.LED紅藍光質調控辣椒幼苗生長的光合機制研究［J］.河南農業科學，2021，50（7）：145-153.

［8］屈成，劉芬，陳光輝，等.LED紅藍光質對水稻幼苗生長及生理特性的影響［J］.核農學報，2020，34（9）：2095-2102.

［9］任爽爽，雋樂梅，柳倩，等.油茶隱花色素基因CoCRY1的克隆及功能研究［J］.植物遺傳資源學報，2023，12（23）：1-12.

［10］DOMINIK I，RAMONA S，JOACHIM H，et al.Blue light induces radical formation and autophosphorylation in the light-sensitive domain of Chlamydomonas cryptochrome［J］.The Journal of biological chemistry，2007，282（30）：21720-21728.

［11］IMMELN D，POKORNY R，HERMAN E，et al.Photoreaction of plant and DASH cryptochromes probed by infrared spectroscopy：the neutral radical state of flavoproteins［J］.Journal of Physical Chemistry B，2010，114（51）：17155-17161.

［12］李旺寧，張豪杰，李亞男，等.萊茵衣藻藍光受體植物類型隱花色素CRY突變體的表型鑒定［J］.生物技術通報，2023，39（2）：243-253.

［13］ASIMGIL H，KAVAKLI I H.Purification and characterization of five members of photolyase/cryptochrome family from Cyanidioschyzon merolae［J］.Plant Science，2012，185-186（none）：190-198.

［14］DENG，CASPAR，QUAIL.cop1：a regulatory locus involved in light-controlled development and gene expression in Arabidopsis［J］.Genes & Development，1991，5（7）：1172-1182.

［15］DENG X W，QUAIL P H.Genetic and phenotypic characterization of COP-1 mutants of Arabidopsis thaliana［J］.Plant Journal，2010，2（1）：83-95.

［16］周璐，饒楓.動植物中COP1泛素連接酶介導的信號轉導與蛋白質穩態調控［J］.生物化學與生物物理進展，2023，50（4）：714-724.

［17］H S S，J Y Y，ISHIKAWA M，et al.LAF1 ubiquitination by COP1 controls photomorphogenesis and is stimulated by SPA1［J］.Nature，2003，423（6943）：995-999.

［18］YANG J.Light Regulates COP1-Mediated Degradation of HFR1，a Transcription Factor Essential for Light Signaling in Arabidopsis［J］.Plant Cell，2005，17（3）：804-821.

［19］OSTERLUND M T，NING W，WANG D X.The Roles of Photoreceptor Systems and the COP1-Targeted Destabilization of HY5 in Light Control of Arabidopsis Seedling Development［J］.Plant Physiology，2000，124（4）：1520-1524.

［20］HOLM，M.Two interacting bZIP proteins are direct targets of COP1-mediated control of light-dependent gene expression in Arabidopsis［J］.Genes & Development，2002，16（10）：1247-1259.

［21］JUN-JIE，LING，JIAN，et al.Noncanonical role of Arabidopsis COP1/SPA complex in repressing BIN2-mediated PIF3 phosphorylation and degradation in darkness［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114（13）：3539-3544.

［22］PONNU J.Molecular mechanisms suppressing COP1/SPA E3 ubiquitin ligase activity in blue light［J］.Physiologia Plantarum，2020，169（3）：418-429.

［23］韓玉瑩.光質介導球等鞭金藻巖藻黃素和脂肪酸積累及其藍光受體IgCRY1結構解析［D］福州：福建師范大學，2022.

［24］龔林.球等鞭金藻隱花色素基因家族相關研究［D］.福州：福建師范大學，2020.

［25］趙靖悅.三角褐指藻隱花色素/光解酶的研究［D］.福州：福建師范大學，2020.

［26］劉嘉嘉，梁小君，周琳琳等.不同光質對壇紫菜果孢子和殼孢子萌發的影響［J］.應用海洋學學報，2023，42（03）：409-415.

［27］崔連花.玉米ZmCOP1基因的克隆和功能分析［D］.河南：河南農業大學，2022.

（責任編輯：柯文輝）