響應面法優化釀酒酵母發酵產谷胱甘肽工藝

林偉鈴 朱宏陽 李泳寧

林偉鈴，朱宏陽，李泳寧.響應面法優化釀酒酵母發酵產谷胱甘肽工藝［J］.福建農業科技，2023，54（12）：27-34.

收稿日期：2023-11-10

作者簡介：林偉鈴，女，1984年生，碩士，實驗師，主要從事微生物在生產中的應用研究。

*通信作者：朱宏陽，男，1979年生，博士，副教授，主要從事微生物在生產中的應用研究（E-mail：zhuhongyang@fjwzy.cn）。

基金項目：福建省自然科學基金項目（2022J01394），福建省衛健委青年基金項目（2019-1-97）。

摘? 要：為了探索釀酒酵母發酵生產谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的最佳工藝條件。在單因素試驗基礎上，通過Plackett-Burman試驗結合響應面設計方法對液體發酵培養基進行優化。結果表明：釀酒酵母發酵生產GSH的最優培養基配方為葡萄糖71 g·L-1、酵母膏4 g·L-1、NH4Cl 6 g·L-1、KH2PO4 2.0 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1，pH 6.0，在此條件下，GSH理論產量達79.51 mg·L-1。經3批次平行試驗驗證，GSH實際產量均值為80.5 mg·L-1，與預測值相近，較優化前產量（65.03 mg·L-1）提高了約19.2%。

關鍵詞： 釀酒酵母； 谷胱甘肽; Plackett-Burman設計； 響應面分析； 優化

中圖分類號：TQ 921? ???文獻標志碼：A? ???文章編號：0253-2301（2023）12-0027-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.12.004

Technology Optimization for the Production of Glutathione Fermented by Saccharomyces cerevisiae

LIN Wei-ling， ZHU Hong-yang*， LI Yong-ning

（Department of Pharmacy， Fujian Health College， Fuzhou， Fujian 350101， China）

Abstract： In order to explore the optimal technological conditions for the production of glutathione （GSH） fermented by Saccharomyces cerevisiae， based on the single factor experiment， the liquid fermentation medium was optimized through Plackett-Burman design experiment combined with the response surface methodology. The results showed that the optimal culture medium for the production of GSH fermented by Saccharomyces cerevisiae was as follows： glucose of 71 g·L-1， yeast extract paste of 4 g·L-1， NH4Cl of 6 g·L-1， KH2PO4 of 2.0 g·L-1， MgSO4 of 0.5 g·L-1， pH of 6.0. After three batches of parallel experiments， the mean value for the actual yield of GSH was 80.5 mg·L-1， which was similar to the predicted value and increased by about 19.2% higher than that before optimization （65.03 mg·L-1）.

Key words： Saccharomyces cerevisiae； Glutathione； Plackett-Burman design； Response Surface analysis； Optimization

谷胱甘肽（Glutathione，簡稱GSH）是普遍存在于細胞中的一種含巰基的功能活性三肽，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和L-甘氨酸縮合而成，是真核細胞中小肽類巰基化合物的重要組成部分［1］。GSH在細胞內存在還原型及氧化型兩種形式，還原型GSH是生物細胞抵抗氧化損傷的關鍵，有著多種重要的生理功能［2］。GSH具有增強機體免疫、抗氧化、解毒、提高動物生殖能力等功效，被廣泛應用于農作物種植、畜禽水產養殖、食品及醫藥等領域［3-6］，具有良好的市場前景。研究發現，在農業生產中使用GSH灌溉澆種可以提高農作物對鉛、砷、鎘、微塑料以及鹽堿的耐受性［7-11］。此外，在食品應用領域，Tang等［12］的研究發現GSH可以通過氫鍵與淀粉相互作用，加速淀粉顆粒的膨脹，促進有序雙螺旋結晶的形成，從而抑制淀粉的消化，可應用于減肥食品。

目前，直接萃取法、化學合成法、酶法與微生物發酵法是生產GSH主要方法［5］。其中，微生物發酵法具備生產效率高、成本低、污染少等特點，是目前生產GSH的主要方法［13］。在產GSH微生物中，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae因其在廉價原料培養基中生長迅速，且具有在細胞中積累高含量GSH的潛力而脫穎而出［14］。此外，釀酒酵母是FDA規定的無害食品添加劑，屬于一般公認的安全類添加劑，適合用于GSH的商業化生產［15］。自1970年開始，日本協和發酵生物株式會社（Kyowa Hakko Bio）用酵母發酵生產GSH，目前占據我國GSH市場供應的主要份額。國內GSH生產還停留在工廠實驗階段或生產起步階段，制約國內生產GSH的主要原因是生產水平較低、提取率低下。因此如何提高GSH生產效率、降低生產成本、提高競爭力，對于實現GSH自主生產、打破外國企業的壟斷具有非常重要的意義。本研究對前期篩選獲得的具有GSH生產能力的菌株Saccharomyces cerevisiae ZF-11進行發酵條件優化，旨在提升GSH產量，為大規模發酵生產GSH提供依據。

1? 材料與方法

1.1 ??菌株

釀酒酵母S.cerevisiae ZF-11，由本實驗室篩選并保藏。

1.2? 試劑與培養基

斜面培養基與菌種活化培養基：葡萄糖30 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、瓊脂粉20 g·L-1，pH 6.0，121℃滅菌20 min。種子培養基：葡萄糖30 g·L-1、酵母膏3 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1，pH 6.0，121℃滅菌20 min?；A發酵培養基：葡萄糖50 g·L-1、酵母膏5

g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、KH2PO4 2 g·L-1、MgSO40.5 g·L-1，pH 6.0，121℃滅菌20 min。

試劑：四氧嘧啶為分析純。

1.3? 主要儀器

SW-CJ-1F超凈工作臺（上海蘇凈實業有限公司）、ZQZY-88CN全溫振蕩培養箱（上海知楚儀器有限公司）、SPX-100-B-Z細菌生化培養箱（福建省科學器材中心）、SBA-40E型生物傳感儀（山東省科學院生物研究所）、SQ810C全自動高壓蒸汽滅菌器（雅馬拓）、H2-16KR臺式高速冷凍離心機（湖南可成儀器設備有限公司）、DHG-9070電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏）、UV-1800型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.4? 試驗方法

1.4.1? 種子液制備? 將斜面保藏的菌種接入活化培養平板，28℃條件下于細菌生化培養箱中培養24 h，從活化平板上挑取一環菌接入裝有種子培養基的三角瓶中，28℃、220 r·min-1振蕩培養24 h。

1.4.2? 發酵條件? 將種子液以10%接種量接入到發酵培養基中，28℃、220 r·min-1振蕩培養72 h。

1.4.3? 菌體濃度的測定? 取25 mL發酵培養液，5000 r·min-1離心10 min收集菌體，用蒸餾水重懸菌體后5000 r·min-1離心10 min收集菌體（重復3次），于電熱恒溫鼓風干燥箱中70℃烘至恒重后稱重。

1.4.4? 發酵液中葡萄糖的測定? 取1 mL發酵培養液進行適當稀釋后用生物傳感儀測定葡萄糖的含量。

1.4.5? GSH含量的測定［16］? 取25 mL發酵培養液，5000 r·min-1離心10 min收集菌體，用蒸餾水重懸菌體后于-20℃冷凍過夜，沸水浴5 min，

5000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用四氧嘧啶法測定GSH含量。

1.4.6? 單因素試驗? （1）不同碳源對釀酒酵母發酵產GSH的影響。發酵培養基中的碳源分別為葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、木糖，碳源加入量為5%，其余成分與基礎發酵培養基一致，進行發酵試驗，考察不同碳源對釀酒酵母菌體生長和產GSH的影響。（2）葡萄糖濃度對釀酒酵母發酵產GSH的影響。以葡萄糖為碳源，濃度分別40、50、 60、70、80、90、100 g·L-1，其余成分與基礎發酵培養基一致，進行發酵試驗，考察釀酒酵母菌體生長和產GSH的最佳葡萄糖濃度。（3）不同氮源對釀酒酵母發酵產GSH的影響。以70 g·L-1葡萄糖作為碳源，氮源分別為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4，氮源添加量為1%，其余成分與基礎發酵培養基一致，進行發酵試驗，考察不同氮源對釀酒酵母菌體生長和產GSH的影響。（4）復合氮源對釀酒酵母發酵產GSH的影響。以70

g·L-1葡萄糖作為碳源，酵母膏分別與尿素、NH4Cl、（NH4）2SO4以1∶1的量復配作為氮源，總氮源添加量為1%，其余成分與基礎發酵培養基一致，進行發酵試驗，考察不同的有機氮源與無機氮源復配組合對釀酒酵母菌體生長和產GSH的影響。（5）復合氮源酵母膏與NH4Cl配比對釀酒酵母發酵產GSH的影響。以70 g·L-1葡萄糖作為碳源，調整酵母膏與NH4Cl的配比，分別為4∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶3、1∶4，總氮源添加量為1%，其余成分與基礎發酵培養基一致，進行發酵試驗，考察復合氮源酵母膏與NH4Cl的不同配比對釀酒酵母菌體生長和產GSH的影響。

1.4.7? Plackett-Burman試驗設計? 在單因素試驗基礎上，采用Plackett-Burman（PB）試驗設計［17］對影響釀酒酵母菌體濃度和產GSH的6個因素的顯著性進行評估，這6個因素分別為：葡萄糖、酵母膏、NH4Cl、KH2PO4、MgSO4、溫度。Plackett-Burman試驗的因素及水平見表1。

1.4.8? 響應面試驗設計? 根據Plackett-Burman試驗結果，選取3個影響菌體濃度和產GSH的關鍵因素，分別是葡萄糖、酵母膏、NH4Cl。根據三因素五水平的中心組合設計試驗原理，以葡萄糖（X1）、酵母膏（X2）、NH4Cl（X3）為自變量，以酵母菌體濃度及GSH產量為響應值，設計中心組合試驗，各因素的試驗水平及編碼值見表2。

2? 結果與分析

2.1? 單因素試驗結果

2.1.1? 不同碳源對釀酒酵母發酵產GSH的影響? 由圖1可知，以葡萄糖為碳源時，菌體生長良好且GSH產量最高，以果糖、蔗糖為碳源時，菌體生長良好且GSH產量較高，麥芽糖可促使菌體生長但GSH生產能力差，S.cerevisiae ZF-11不能利用木糖。綜合菌體濃度及GSH產量考慮，確定葡萄糖為最佳碳源，此時菌株菌體濃度為12.67 g·L-1，GSH產量為65.03

mg·L-1。

2.1.2? 碳源濃度對釀酒酵母發酵產GSH的影響? 由圖2可知，隨著葡萄糖濃度的提高，菌株生長逐步受到影響，當葡萄糖濃度增至100 g·L-1時，菌株的生長受到抑制。從對菌株生長的影響來看，低碳源濃度有利于菌體生長。從GSH產量上看，隨著碳源濃度的升高，GSH產量逐步增加，當碳源濃度升至70 g·L-1時，GSH產量最高（69.32 mg·L-1），而后碳源濃度繼續上升，GSH產量開始迅速下降。分析原因可能是高濃度的碳源抑制了菌株的生長，進而影響產物GSH的合成。

2.1.3? 不同氮源對釀酒酵母發酵產GSH的影響? 由圖3可知，以酵母膏為氮源，菌體生長良好且GSH產量最高；以牛肉膏和蛋白胨為氮源，菌體生長良好，但在生產GSH方面的表現不如以酵母膏為氮源；以NH4Cl、尿素和（NH4）2SO4為氮源，在菌體生長方面不如有機氮源，但對GSH生產具有較好的效果。所以后續試驗選擇酵母膏與無機氮源復配，進一步考察復合氮源對GSH發酵生產的影響。

2.1.4? 復合氮源對釀酒酵母發酵產GSH的影響? 由圖4可知，相比以無機氮源為唯一氮源，有機氮源酵母膏與無機氮源復配的復合氮源能夠使得菌體生長良好，同時GSH的產量又比以酵母膏作為唯一氮源時得到提高。其中，酵母膏和NH4Cl組成的復合氮源在發酵生產中GSH產量最高，所以后續試驗選擇酵母膏與NH4Cl復配的復合氮源。

2.1.5? 復合氮源酵母膏與NH4Cl對釀酒酵母發酵產GSH的影響? 由圖5可知，酵母膏和NH4Cl配比為2∶3時，GSH產量最高，此時產量為74.42

mg·L-1。

2.2? Plackett-Burman試驗結果

Plackett-Burman試驗各因素水平取值及試驗結果見表3，分析結果見表4。利用Statistica 8.0統計軟件對數據進行計算和分析，該模型顯著（R2=0.99927），通過回歸系數顯著性可知葡萄糖（P=0.0235）、酵母膏（P=0.0360）、NH4Cl（P=0.0362）都在95%的概率水平上差異顯著；KH2PO4、MgSO4和溫度的P值介于0.5～0.1，屬于邊界因素，因此KH2PO4、MgSO4和溫度仍選擇初始值作為后續試驗參數。本研究選擇葡萄糖、酵母膏、NH4Cl作為影響菌體生長及GSH產量的關鍵影響因素。

2.3? 響應面試驗設計結果

中心組合試驗設計及結果見表5。通過Statistica 8.0統計軟件對表5中試驗數據進行了二次多項式回歸擬合，獲得了S.cerevisiae ZF-11發酵生產GSH對葡萄糖、酵母膏、NH4Cl多元回歸方程為：

Y=3.328X1-7.907X12+0.899X2-5.090X22-0.198X3-4.984X32-1.175X1X2-0.720X1X3-1.380X2X3+79.319

該方程R2=0.899，這表明模型可以用來解釋試驗結果，對擬合方程求極值得：X1=71.03，X2= 4.03，X3=6.00，代入回歸方程得最大值Y=79.51 mg·L-1。上述回歸方程所作出的響應曲面圖及其等高線見圖6、7、8，各因素及其交互作用對響應值的影響結果可通過該組圖直觀反映出來。

2.4? GSH發酵生產最佳條件及驗證試驗

經響應面分析，比較回歸方程的解，為試驗操作的方便，GSH發酵生產最佳發酵培養基配方為葡萄糖71 g·L-1、酵母膏4 g·L-1、NH4Cl 6 g·L-1、KH2PO4 2 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1， pH 6.0。在該條件下預測GSH產量為79.51 mg·L-1。在該模型處經過3次平行試驗驗證，測得GSH產量均值為80.5 mg·L-1（GSH產量較優化前提高19.21%），菌體濃度均值為20.3 g·L-1。此結果與預測值接近，證實了模型的有效性及存在著極大值點，能很好地預測實際發酵情況。

3? 結論與討論

本研究考察了碳源以及氮源對S.cerevisiae ZF-11發酵生產GSH的影響，結合Plackett-Burman試驗及響應面分析結果表明：在碳源試驗中發現葡萄糖為最適碳源，氮源以酵母膏與NH4Cl配比為2

∶3時最優。通過Plackett-Burman試驗篩選獲得葡萄糖、酵母膏及NH4Cl為顯著影響因素，利用響應面試驗設計優化后，獲得最佳培養基配方：葡萄糖71 g·L-1、酵母膏4 g·L-1、NH4Cl 6 g·L-1、KH2PO4 2.0 g·L-1、MgSO4 0.5 g·L-1，pH 6.0。在上述最佳培養條件下GSH產量可達80.5 mg·L-1，菌體濃度為20.3

g·L-1，GSH產量較優化前提高19.21%。本研究證明了S.cerevisiae ZF-11具有生產GSH的商業價值，有助于開發更經濟的GSH發酵生產工藝。

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（責任編輯：柯文輝）