代謝組學在單細胞領域應用的研究進展

欒瑞雪 李雷 儀書源 李云琦 王壽世

［摘要］

單細胞代謝組學（SCM）是以高通量檢測和數據處理為手段，以組群指標分析為基礎，以信息建模和系統集成為目標，對特定生理時期的某種細胞的所有小分子量代謝物進行定量和定性分析。本文綜述了近年來代謝組學在單細胞領域中的研究及應用進展，并對其在醫學領域的最新應用進行了詳細的討論。

［關鍵詞］ 代謝組學；高通量篩選分析；顯微鏡檢查，原子力；流式細胞術；綜述

［中圖分類號］ R34;R446-33

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）06-0941-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.186

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20231229.1009.002;2024-01-02 10：45：53

RESEARCH ADVANCES IN THE APPLICATION OF METABOLOMICS IN THE FIELD OF SINGLE-CELL ANALYSIS

LUAN Ruixue， LI Lei， YI Shuyuan， LI Yunqi， WANG Shoushi

（School of Anesthesiology， Weifang Medical College， Weifang 261053， China）

; ［ABSTRACT］Single-cell metabolomics is a quantitative and qualitative analysis of all low molecular weight metabolites wi-

thin a certain type of cells at a specific physiological status， through high-throughput detection and data processing of sets of indicators for information modeling and system integration. This article reviews the research and application progress of metabolomics in the field of single-cell analysis in recent years， focusing on its latest application in the medical field.

［KEY WORDS］metabolomics; high-throughput screening assays; microscopy， atomic force; flow cytometry; reviews

代謝組學可以檢測到所有的小分子，更具體地說，是分子量小于2 000的化學物質［1-2］。通過代謝組學的研究，可以獲得與代謝物及其產物變化和代謝途徑相關的生物學信息。相對于僅顯示細胞群共同特征的整體細胞分析，單細胞代謝組學（SCM）能夠較為準確地發現細胞群體的特殊特征［3-5］。SCM是目前僅有的可以描述只在幾秒或幾分鐘內發生的細胞實時生化反應的分析技術［6］，它能夠對不同細胞群中的細胞進行準確的生化表征，幫助我們深入了解各種細胞代謝機制。本文將從SCM的概念和常用方法、最新應用精選實例及其挑戰和展望等方面進行綜述。

1 SCM的概念及發展歷史

1.1 SCM的定義

SCM是一種基于單個細胞水平對其代謝過程進行研究分析的技術。其基本原理是應用高通量測序技術，對單個細胞的代謝物進行檢測。SCM具有高靈敏度和高分辨率，能夠對細胞內的微小變化進行檢測，相比于多細胞或組織可以有效地避免由于細胞異質性引起的誤差，并且可反映單一細胞功能以及揭示細胞異質性與其代謝間的關系［7-8］。

1.2 SCM的實驗流程

與其他組學的流程類似，SCM分析的流程可以概述為：①靶細胞或者靶細胞類型鑒定；②靶細胞檢測樣本的制備；③應用SCM技術分析樣本；④SCM數據分析；⑤差異代謝物鑒定及相關代謝通路研究；⑥數據的生物學解釋及后續實驗［4，9-10］。但不同實驗的SCM分析步驟可根據不同的實驗要求進行適當的調整。

SCM分析最常見的障礙是分離單個檢測細胞。根據細胞內、外不同的特性，可以通過一些方法從不同類別的細胞混合物中分離出單個細胞［7-8］。常見的細胞樣本制備方法包括通過原子力顯微鏡探針直接可視化和穿透/提取、熒光激活細胞分選及微流控陣列等。其中第一種方法只保留了探針中的細胞代謝物，而后兩種方法卻可以保留細胞的完整原始形態［7］。

1.3 SCM的發展歷史

代謝組學是20世紀90年代中期發展起來的一門新興學科，目前已經在疾病早期診斷、藥物靶點發現、疾病機制研究及疾病診斷等方面取得了許多重大成果。生物學研究的歷程往往要經過從宏觀表型的觀察到微觀機制的探索，最后再回到宏觀表型的解釋和修正。而代謝組學起步較晚，并且與DNA和RNA不同，代謝物無法擴增，一些非常稀少的代謝物依賴更為靈敏的檢測方法。此外，代謝物的濃度也可能會在很短時間內發生顛覆性的變化，這些都決定了SCM的研究正面臨著諸多困難。

2 目前常用的SCM研究方法或技術

常用的SCM分析方法主要包括質譜法、色譜法、熒光法以及超微電極電化學方法，其中單細胞質譜法（SCMS）已經成為目前應用最為廣泛的分析方法。

2.1 SCMS

質譜法憑借其高特異性、高靈敏度、強大的結構解析能力以及準確定量能力，近年來廣泛應用于單細胞分析中。例如，有學者使用氣相色譜-質譜儀測量單個海兔（海參）神經元中氨基酸的濃度［11-12］。

根據使用離子化技術的不同分為如下4類：納升電噴霧離子化質譜法、激光解吸附離子化質譜法、二次離子質譜法和電感耦合等離子體質譜法［13］。納升電噴霧離子化質譜法是一種具有高靈敏度和高離子化效率的“軟”離子化技術，廣泛應用于生命科學領域［14-17］，與傳統的電噴霧離子源相比具有更充分的離子化時間和更高的離子化效率［14，18］。激光解吸附離子化質譜法是利用一種特定波長的激光實現目標化合物的解吸附和離子化的，其中，基質輔助激光解吸電離可利用激光能量吸收基質并以最小碎片化的方式從大分子中產生離子［14， 19］。二次離子質譜法是一種兼具高分辨率和高靈敏度的表面分析質譜技術［20-21］，該法通常是使用特殊的高能一次離子束給予樣品表面轟擊處理將待測分子離子化。電感耦合等離子體質譜法是一種可以通過利用高溫等離子體將檢測樣品原子化和離子化來實現多種同位素和金屬元素的質譜定性和定量分析的無機元素質譜離子法［22］，具有多元素檢測、低檢測限、高分辨率等優點［23-24］。

2.2 色譜法

色譜法是一種可以定義為在流動相和固定相組成的恒定場中，因為物質和該兩相作用差異的原因而將物質彼此分離開來的方法［25］。早在1903年，就有研究人員發現并研究了色譜分離法［18，26］。色譜法通常分為高效液相色譜法、毛細管電泳法［27］、開管毛細管親和液相色譜法等，這些檢測技術由于分離效率高、質量檢測限低等優勢，已經廣泛應用于SCM的檢測。然而，色譜法的劣勢在于樣品前處理、衍生和分離等方面花費的時間較多，導致分析效率低下。

2.3 熒光法

對于單細胞的研究，熒光法是其中一種經典的分析方法［28-29］。熒光顯微成像法是實時觀測單細胞物質釋放的重要工具，其原理是利用熒光衍生反應，即通過熒光探針標記囊泡或者關鍵蛋白分子［30］，但是熒光探針的波長寬度有一定限制，在有限光窗下只能檢測3～4種不互相干擾的物質［31］。熒光顯微成像法主要采用納米顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡等實時監測分泌囊泡、蛋白分子的運動。

2.4 超微電極電化學方法

超微電極電化學技術是實時觀測單個細胞釋放兒茶酚胺類遞質等具有電化學活性信號分子的主要技術。這種技術一般采用半人工突觸模式以及安培法將電極靠近單個細胞，在500～800 mA的電流條件下實時觀測擴散到電極表面的信號分子。超微電極電化學技術雖然具有尺寸小、靈敏度高、響應速度快的優勢，但卻局限于只能檢測細胞釋放的物質。此外，這種技術只能用于檢測具有電化學活性信號分子的物質［32-33］。

3 SCM在不同研究領域的應用

SCM在腫瘤的診斷與藥物治療方面的應用廣泛［34-35］，它不僅可以發現惡性腫瘤新的治療組合策略，還可能有助于識別藥物毒性的早期跡象［34，36-38］。腫瘤細胞在發生遺傳或非遺傳改變時，會進行代謝重排以適應其免疫逃逸、快速生長、增殖、侵襲及轉移所需要的物質基礎和能量等變化。由于致癌活性、增殖狀態、營養物質的可獲得性及微環境在空間和時間上的不同，使得眾多癌癥類型的代謝過程變化各不相同［39］。白血病細胞的代謝改變通常表現為葡萄糖消耗水平大幅提高、脂肪生成增加以及谷氨酰胺分解等，這些差異代謝變化為惡性血液系統腫瘤提供了新的治療方案——靶點的競爭性葡萄糖代謝及靶向谷氨酰胺代謝［39-41］。此外，代謝重排有助于形成腫瘤細胞免疫抑制的微環境，導致抗癌治療的耐藥性增加［42-43］。但是，通過SCM分析并結合遺傳信息，可以區分驅動耐藥發展的調控途徑和相關基因并找到改善抗癌治療耐藥性的新方法［44］，例如CHEN等［45］將不同處理條件下的活伊立替康耐藥細胞利用SCM技術進行了分析，證實了二甲雙胍-伊立替康協同作用可以克服耐藥。

SCM在神經學領域被廣泛應用。神經元對比正常細胞有非常詳細的亞型且體積更大，由疾病或信號導致的神經系統一系列變化通常會在單個細胞中得到反映［46-47］。當前其多組學聯合分析在結合神經細胞的生理學、形態學之后，將不斷推進人類腦部疾病的診斷及治療發展進程［44-45，48-50］。

SCM在其他人類精準醫學領域也有很深入而廣泛的應用。①SCMS揭示感染細胞異質性。NGUYEN等［51］研究了寄生蟲克氏錐蟲感染宿主細胞的異質性。這是首次在哺乳動物感染性疾病中應用SCM分析技術，即使用單探針SCMS技術對克氏錐蟲異質性感染細胞進行SCM研究。②脂類分析是SCMS的另一個最新應用［52-54］。準確而深入地表征類脂異構體在脂類組學研究領域中十分關鍵［12，55］。針對這一現狀，LI等［55］開發了一種單細胞脂質組學的工作流程，即使用單細胞的光化學衍生化、電遷移和常壓電離串聯質譜法來量化區分脂質水平。

4 SCM的挑戰及展望

綜上所述，SCM在很多方面具有巨大的應用潛力，然而，仍還有一些挑戰需要進一步解決。例如：①代謝組樣本變化很快，這導致了代謝物及其相關產物的鑒定困難；②代謝物的豐度在單個細胞中可能會有非常大的差異，而微小代謝物需要具有高靈敏度的檢測技術才能檢測到，此外，單細胞內代謝物隨時間變化的速率如何進行量化也仍是一個大挑戰；③許多代謝組分析工具并不能覆蓋更多滿足不同研究需求的代謝物［3］。值得高興的是，最近分子生物學技術和計算方法的快速進展使上述問題不斷得到解決。

SCM分析作為一個新興的研究領域，近年來受到越來越多的關注［56-58］。隨著更高效、更廉價的高通量技術的出現及革新，跨模式的單細胞組學的聯合將會極大擴展我們的視野，加深我們對不同生物層之間相互作用的理解［59］?？偠灾?，我們可以預見SCM分析將繼續在具有不同表型的單個細胞或細胞亞群的研究中不斷取得新成果，這些成果對細胞分化、疾病的發生和發展以及藥物治療等方面至關重要。相信在不久的未來，SCM分析將在各個領域的基礎研究和精準醫學的發展等方面大放異彩。

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（本文編輯 劉寧）