腸道菌群在非酒精性脂肪肝炎癥反應中的作用

袁夢淑，宋紅麗

（1.天津醫科大學一中心臨床學院，天津 300192；2.天津市第一中心醫院肝移植科，天津市器官移植重點實驗室，天津市器官移植臨床醫學研究中心，天津 300192）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）主要包括兩大病理過程：非酒精性肝脂肪變性（nonalcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH）。NAFL 僅僅指肝細胞內甘油三酯聚集，在肝細胞內形成脂滴，肝細胞脂肪變性，而NASH 以脂肪性肝炎、肝細胞損傷和炎癥反應為特點。超過40%的NASH 患者均可發現門脈和肝小葉炎癥［1-4］。因此，減輕NAFLD 患者的全身慢性低度炎癥反應，有助于延緩NAFLD 的發展。

腸道菌群及其代謝物是模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）的重要配體。腸道黏膜免疫系統中的Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）和Nod 樣受體（nod-like receptors，NLRs）可以識別細菌代謝產物，例如：脂多糖（lipopolysaccharide ，LPS）、鞭毛蛋白和肽聚糖，從而抵御外來病原體入侵，而肝臟中的TLRs、NLRs 及炎癥小體促進肝臟炎癥反應，在NAFLD 的發展中發揮重要作用。

1 腸道菌群通過免疫細胞引起NAFLD 炎癥反應

在NASH 中，初級免疫和由淋巴細胞介導的適應性免疫共同促進肝臟炎癥的發生。脂肪變性、肝小葉淋巴細胞浸潤和肝細胞氣球樣變是肝細胞損傷的典型變化［5］。肝小葉淋巴細胞浸潤被認為是NAFLD 向肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌轉變的重要病理變化［6］。大約60%的NASH 患者可見B 細胞和T 細胞的灶狀聚集，這些灶聚狀集的大小和多少與肝小葉炎癥和肝纖維化評分密切相關［7］。大量NASH 動物模型均證實CD4+和CD8+T 細胞、B 細胞、自然殺傷T 細胞（natural killer T cell ， NKT cell）、庫普弗細胞在脂肪性肝炎中的浸潤，而且浸潤程度與肝實質損傷密切相關。

基因敲除ob/ob 肥胖小鼠（肥胖自發突變的純合子小鼠Lepob，通常寫作ob 或ob/ob）通常對LPS介導的肝臟損傷更敏感，與痤瘡丙酸桿菌感染的正常小鼠的肝臟損傷相似。小鼠經LPS 處理后血漿中白細胞介素（interleukin，IL）-18 水平增高，肝臟CD4+、NK 細胞數量下降，IL-4 生成減少，使Th-1和Th-2 細胞之間的平衡被破壞，導致Th-1 細胞來源的促炎細胞因子相對增多，Th-2 來源的抗炎細胞因子相對減少［8-9］。

B 細胞通常出現在富集T 細胞的淋巴細胞浸潤灶，并與脂肪性肝炎的發生密切相關。在小鼠NAFLD 模型中，浸潤B 淋巴細胞主要有2 種：B1 淋巴細胞可在多種抗原刺激下激活產生IgM 型抗體。B2 亞群需要T 輔助細胞增殖，分化為漿細胞產生高度抗原特異性的IgA、IgG、IgE［10］。

庫普弗細胞定位于肝血竇中，與來自腸道的血液密切接觸，比外周血更容易暴露在腸道來源的內毒素、飽和脂肪酸、膽固醇及其代謝物以及與肝細胞損傷相關的分子中。不同于脂肪組織，肝臟擁有基數較大的巨噬細胞，大約占肝臟所有細胞的5%。庫普弗細胞的數量不隨脂肪的增加而增加，但它們的活化狀態與脂肪成正比［11-12］。臨床研究發現，M1型庫普弗細胞活化與肝細胞脂肪性變和凋亡、募集免疫細胞、肝纖維化有關，而M2 型庫普弗細胞則能減輕炎癥反應和肝臟損傷，M1/M2 型庫普弗細胞的比例在NAFLD 的慢性炎癥中發揮著重要作用［13］。體內和體外試驗均證實，當肝臟暴露于LPS 時，庫普弗細胞通過產生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-1 來消滅LPS 的細胞毒作用［14-16］。NAFLD中的庫普弗細胞活化不僅限于肝臟，它們在脂肪組織中的存在有助于在肥胖中觀察到的低度炎癥，并且還與NAFLD 組織學有關［17］。

2 腸道菌群通過模式識別受體引起NAFLD 炎癥反應

無論是病原微生物還是共生微生物，它們與宿主的互作主要通過宿主天然免疫細胞表達的PRRs 實現。這些PRRs 識別病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns， PAMPs，現在也叫做代謝相關分子模式，microbe-associated molecular patterns， MAMPs）和宿主來源的損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）。目前已經發現的模式識別受體有6 種［18-19］，包括：① TLRs，這是一類跨膜分子，主要定位于細胞膜或內涵體膜，胞外區識別配體，胞內區負責傳遞信號，引起炎癥因子表達和Ⅰ型干擾素生成。② C 型凝集素樣受體（C-type lectin-like receptors， CLRs），也是一種跨膜分子，主要包括Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3，識別來源于真菌的糖類分子。③ NLRs，這是一類細胞內感應分子，可以識別多種PAMPs 和DAMPs。④ 維甲酸誘導基因樣受體（retinoic acid inducible gene Ⅰ - like receptors，RLRs）是一種胞內受體，主要識別病毒來源的核酸，啟動抗病毒免疫信號。⑤ AIM2 樣受體（absent in melanoma 2-like receptors， ALRs）主要在胞漿中識別DNA，啟動天然免疫信號。⑥ 環鳥苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase， cGAS）主要識別細胞中異常存在的雙鏈DNA［20］，其介導干擾素基因刺激因子（stimulator of interferon genes， STING）的激活，即cGAS-STING 感受通路，誘導Ⅰ型干擾素產生，抵御病原微生物感染。

部分NLRs 和ALRs 可以招募其他蛋白，如ASC和pro-Caspase-1，形成炎癥小體，活化Caspase-1進行切割pro-IL-1β 和/ 或pro-IL-18， 使之成熟和分泌，或者切割gasdermin， 引起細胞焦亡（pyroptosis）， 在抗感染和維持機體免疫穩態中非常重要［21］。與腸道菌群所致炎癥反應有關的PRRs 主要是TLRs 和NLRs，以及部分NLRs 組裝成的炎癥小體。

2.1 TLRs 家族：在哺乳動物中，已被確認的Toll樣受體有13 種（人類為TLR1-TLR10；小鼠為TLR1-TLR13，沒有TLR10），可被分為2 大類：表達于細胞膜表面（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR11）和表達于細胞內吞體膜（如核內體、溶酶體、內質網）表面（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）［22］。細菌成份（LPS、蛋白、聚糖和核酸等）可激活TLRs，刺激免疫細胞產生炎癥因子和共刺激分子［22-23］。其中TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 與NAFLD 的發生發展密切相關［24］。

TLR2 通常與TLR1、TLR6 或一些非TLR 分子（如Dectin-1）形成異二聚體，通過MyD88 依賴途徑與NOL1 和NOL2 共同識別肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、脂磷壁酸（lipoteichoic acid，LTA）、脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomannan，LAM）、脂蛋白及脂肽等多種菌體成份［22］。 TLR2 敲除（TLR2-/-）小鼠可以改善由高脂飲食（high fat diet， HFD）引起的代謝綜合征［25-26］。在膽堿缺乏的氨基酸飼料（choline-deficient amino acid-defined， CADD） 喂養的小鼠中，TLR2 可以激活巨噬細胞中的炎癥小體促進NASH 的發展［27］。然而，也有研究表明，在蛋氨酸和膽堿缺乏飲食（methionine and choline diet，MCDD）引起的脂肪性肝炎中，TLR2-/-小鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ （peroxisome proliferatorsactivated receptor γ， PPAR-γ） 表達量降低，炎癥因子和肝纖維化指標升高［28-29］。這可能是由于不同飲食導致的代謝綜合征表現以及腸道菌群的改變不同，造成TLR2 的作用產生相反的結果。

TLR4 的作用主要是識別LPS。LPS 是革蘭陰性細菌死亡后細胞壁分解的產物，通過脂蛋白運載進入腸道毛細血管，最終匯入門靜脈，肝臟是LPS 的首個靶器官。LPS 激活TLR4 通路引發的慢性低度炎癥是NAFLD 發展的重要因素［10］。LPS 和LPS 結合蛋白（LPS-binding protein， LBP）形成LPS-LBP復合物，在CD14 的引導下，與免疫細胞、血小板及肝細胞表面的TLR4-髓樣分化蛋白2 （Myeloid differentiation protein-2， MD2）復合物結合，可引起兩條通路改變［23］：① TIRAP-MyD88 通路：通過銜接蛋白-髓樣分化因子88（Myeloid Differentiation Protein-88，MyD88）激活IL-1 受體相關激酶（IL-1 Receptor Associating Kinase， IRAK）。此外，它還會通過位于IRAK 下游的銜接蛋白TRAF-6（TNF Receptor-associated Factor-6， TRAF-6）刺激與炎癥反應有關的核因子κB （nuclear factor kappa-B， NFκB）和絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases， MAPKs）等的活化作用，展現其轉錄活性，引發炎癥反應。② Toll 樣受體相關分子（toll receptor associated molecule， TRAM）-Toll 樣受體相關的干擾素活化分子 （TIR domain-containing adaptor inducing IFN-β， TRIF）通路：TLR4 進入細胞質后，便通過TRAM-TRIF 激活TRAF3 和TRAF6。TRAF3刺激干擾素調節因子3 （interferon regulatory factor 3，IRF3）引發Ⅰ型干擾素反應，TRAF6 刺激NF-κB引起炎癥反應。不同細菌產生的不同LPS 結構可選擇性激活這些通路。例如，類脂A 在LPS 的生理活性表現起著最重要的作用，其可不依賴CD14 激活MyD88 通路。

TLR5 可識別細菌鞭毛蛋白。小腸固有層內的CD11c+CD11b+樹突狀細胞膜表面TLR5 被激活后可產生視黃酸調節細胞和體液免疫，促進Th17、Th1分化，加速初級B 細胞的分化為漿細胞，產生IgA，增強腸道免疫功能。TLR5-/-小鼠腸道菌群發生改變，引起低度炎癥信號通路激活，這種炎癥反應交叉致敏胰島素受體通路，引起代謝綜合征［14］。另外，肝細胞表面的TLR5 可緩解由高脂飲食引起的肝臟脂肪變性，加速清除易位在肝臟中的腸道菌腸［30］。在NAFLD 患者中，腸道菌群易位激活TLR5 引起的炎癥反應，可增加患者肝癌的發病率［31］。

TLR9 存在于樹突狀細胞、B 細胞和巨噬細胞內體、溶酶體或內質網中，識別細菌DNA 中的未甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG 島）［8］，通過MyD88 依賴途徑引起炎癥反應和Ⅰ型干擾素反應，刺激細胞產生γ-干擾素（interferon -γ，IFN-γ）、TNF-α、IL-6 等炎癥因子［15］。未甲基化的CpG 寡核苷酸存在于細菌和病毒中，而哺乳動物基因組中含有少量的甲基化的CpG 寡核苷酸，只有線粒體DNA 含有大量未甲基化的CpG 寡核苷酸［32］。NAFLD 患者肝臟中至多有2.5×104個細菌DNA 片段［33］。移位細菌或細菌DNA 被細胞攝取后，便可激活細胞內的TLR9，引起炎癥反應。另外，NASH患者血漿中含有高濃度肝細胞來源的線粒體DNA（mitochondrial DNA， mtDNA），這些mtDNA 也可以通過TLR9 激活先天免疫系統，產生IL-1β，促進NASH、肝纖維化和胰島素抵抗的發展［34］。

2.2 NLRs 家族：NLRs 是胞內模式識別受體的主要成分，其中，NOD1 和NOD2 識別胞內細菌成分；由NLRs 形成的NALP3 炎性小體對多種刺激產生反應，刺激免疫細胞產生IL-1［23］。TLRs、NLRs 最終激活NF-κB 和MAPKs 信號通路，從而調節免疫和炎癥基因表達。

NLRs 家族識別細胞質中的PAMPs 和DAMPs。根據N 端結構，NLR 分為5 個亞群：NLRA、NLRB、NLRC、NLRP、NLRX。迄今為止，至少發現了23 種人類NLR 基因，但是大部分NLRs 的生理功能仍然不清楚。NOD1 和NOD2 屬于NLRC 亞群，可識別所有革蘭陰性細菌和部分革蘭陽性細菌表面的PGN中的不同結構模體，引發炎癥反應。PGN 如何被轉運到細胞質并與NOD1 和NOD2 結合現在仍不清除［23，35］。

2.3 炎性小體：炎性小體是由部分NLRs 組裝的胞漿內PRRs，通過自身催化作用激活caspase-1，引起細胞焦亡、炎癥和纖維化。目前已發現5 種炎性小體：NLRP1、NLRP3、NLRC4、IPAF 和AIM2。NLRP3 炎性小體在肝臟中表達最高，可識別LPS、PGN、LTA、雙鏈DNA 等多種菌體成分［23］，釋放IL-1 家族炎癥因子［35-36］。

3 總 結

在NAFLD 發展過程中，腸道菌群失衡、腸黏膜滲透性改變均增加腸源性病原體匯入門靜脈的概率，使肝臟在腸道菌群導致的炎癥反應中充當重要的靶器官，由此引發的炎癥反應進一步加重了肝細胞損傷和全身炎癥反應引起的代謝障礙。故維持腸道菌群平衡，增加優勢菌和致病菌比例可減輕肝臟炎癥反應，延緩NAFLD的發展。在NAFLD的治療中，不能忽視維持腸道菌群平衡，從而減輕機體炎癥反應及疾病的進展。