膜聯蛋白A家族分泌機制的研究進展

姜 瑋，王 娟

（北京工業大學環境與生命學部，北京 100124）

膜聯蛋白(annexin) 是一類進化保守的鈣離子依賴的磷脂結合蛋白家族，廣泛存在于動植物細胞中[1]。細胞分泌是原核生物和真核生物都存在的一種基本的生理過程，它將可溶的蛋白質和貨物輸送到細胞外。在真核生物中，大多數分泌蛋白通過常規分泌途徑分泌，即從內質網運輸到高爾基體，再由分泌囊泡等運輸到質膜(plasma membrane，PM)[2]。除常規蛋白分泌途徑外，研究發現越來越多的蛋白可以通過非常規途徑分泌，如不攜帶信號肽的胞漿蛋白的胞外分泌、含信號肽的跨膜蛋白繞過高爾基體在細胞表面運輸等[3]。膜聯蛋白由于缺少信號肽，只能通過非常規分泌途徑分泌?，F對膜聯蛋白A家族的非常規分泌途徑進行綜述。

1 膜聯蛋白A家族

1.1 膜聯蛋白A家族概述

膜聯蛋白是一種鈣依賴的磷脂結合蛋白，最早由Creutz等人在腎上腺細胞中分離純化獲得[4]。研究發現的1000多種膜聯蛋白主要存在于脊椎動物、無脊椎動物、植物、真菌中，尚未在酵母和原核生物中發現。脊椎動物常見的12個膜聯蛋白被命名為膜聯蛋白A家族[5]。膜聯蛋白核心區由4~8個重復序列組成，每個重復序列長約70個氨基酸，由5個ɑ螺旋組合形成圓盤結構，包含一個與鈣離子結合的特征‘type2’基序[1]。由于這種保守的一級結構，膜聯蛋白彼此之間具有高度的同一性。在哺乳動物中，任何一種膜聯蛋白與該家族的其他成員都有40%~60%的同源性。膜聯蛋白的N末端結構域包含磷酸化、蛋白質分解，甚至與其他蛋白質相互作用的主要部位，被認為是蛋白質的調節區[6]。

1.2 膜聯蛋白A家族的功能

首先，膜聯蛋白A家族可以促進細胞膜和細胞骨架的形成。膜聯蛋白與磷脂結合后能夠通過其橫向聚集調節雙層膜結構的形成，在此過程中，膜聯蛋白作為膜骨架起到穩定脂質雙層膜結構的作用[7]。研究表明，哺乳動物中的膜聯蛋白A家族以鈣依賴性方式與肌動蛋白微絲結合，介導肌動蛋白微絲的聚集，從而影響細胞骨架的功能[1]。其次，膜聯蛋白A家族參與調節細胞信號轉導。膜聯蛋白A1、A2、A6、A8參與調節表皮生長因子受體(EGFR)信號傳導途徑[8]，且膜聯蛋白A6可以通過招募GTPase激活蛋白（p120GAP）負調控EGFR信號傳導通路[9]。膜聯蛋白A家族也參與細胞增殖和凋亡。在急性早幼粒細胞白血病細胞中，全反式維甲酸誘導的分化與膜聯蛋白A8下調有關，表明其在增殖和分化中發揮作用[10]。膜聯蛋白A5是幾乎所有細胞和組織中含量最豐富的膜聯蛋白，大量的膜聯蛋白A5在細胞外被發現，由于其對質膜外小葉中磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）的強結合親和力，膜聯蛋白A5現在被廣泛用于檢測各種疾病環境中的凋亡細胞[11]。

抗凝和炎癥調節是膜聯蛋白A家族重要的生理病理功能。膜聯蛋白A4和膜聯蛋白A5通過鈣離子調節與磷脂結合，在細胞外發揮抗凝血因子的作用。膜聯蛋白A5的血漿濃度在懷孕期間和產后都很低，且保持不變，有助于防止妊娠期間胎盤內凝血；而膜聯蛋白A4的水平在分娩后不久就會增加，在預防彌漫性血管內凝血病中發揮作用[12]。膜聯蛋白A1是一種糖皮質激素調節蛋白，膜聯蛋白A1基因敲除小鼠白細胞遷移和IL-1β生成增加，表現出抵抗糖皮質激素的抗炎作用[13]。在急性炎癥中，膜聯蛋白A2與肌動蛋白和鈣黏蛋白的相互作用是其調節血管完整性的基礎，其可以協助啟動血管生成，促進組織修復[14]。敲低膜聯蛋白A3可以通過激活PI3K/AKT信號通路，促進心肌組織的修復和愈合[15]。膜聯蛋白A5治療可減輕高膽固醇血癥小鼠缺血后的炎癥反應，改善左室重構，改善高膽固醇血癥小鼠的心功能[16]。

研究發現，膜聯蛋白可以在細胞外發揮作用，但膜聯蛋白是如何從胞內分泌到胞外的仍不清楚。已知膜聯蛋白是可溶性細胞溶質蛋白，缺乏信號肽，因此，膜聯蛋白家族只能通過非常規分泌途徑分泌。

2 膜聯蛋白A家族的非常規分泌途徑

非常規蛋白分泌（unconventional protein secretion，UPS）途徑可以分為四種：Ⅰ型為直接跨質膜轉運，Ⅱ型為通過ABC（ATP-binding-cassette）轉運體轉運，Ⅲ型為基于細胞器的易位和細胞外小泡的分泌，IV型為有信號肽或有跨膜區域的分泌蛋白進入內質網但不經過高爾基體到達細胞質膜的分泌[17]。目前，已知的膜聯蛋白的分泌途徑主要為前三種，即直接跨質膜轉運、通過ABC轉運體轉運、基于細胞器的易位和細胞外小泡的分泌。

2.1 直接跨質膜轉運

直接跨質膜轉運是分泌貨物不需要囊泡中間體而直接跨過細胞膜分泌。膜聯蛋白A6是鈣離子和脂質結合蛋白家族中的一員，它在中等酸性的pH下可以穿透膜的疏水性區域，以不依賴于鈣離子的方式與膜相互作用，并作為膜整合蛋白發揮作用[18]。在低pH條件下，膜聯蛋白A5和膜聯蛋白A12在沒有鈣離子的情況下，能夠暴露在雙層疏水結構域中形成離子通道，可逆地與磷脂囊泡結合[19]。綜上所述，膜聯蛋白可能不需要任何其他中間體，直接跨質膜轉運。

2.2 通過ABC（ATP-binding-cassette）轉運體轉運

ABC轉運蛋白是一種依賴于ATP的膜轉運蛋白，負責運輸離子、重金屬、氨基酸和寡肽等貨物。在哺乳動物細胞中，ABC轉運蛋白也負責無信號肽蛋白的分泌。研究發現，糖皮質激素可以刺激濾泡星狀細胞中膜聯蛋白A1的分泌，在這個過程中觀察到ABCA1轉運蛋白與細胞表面的膜聯蛋白A1共定位，且ABC轉運蛋白抑制劑格列本脲抑制糖皮質激素誘導的膜聯蛋白A1的分泌。由此說明，ABCA1在膜聯蛋白A1的分泌中發揮作用[20]。

2.3 基于細胞器的易位和細胞外小泡的分泌

基于細胞器的易位和細胞外小泡的分泌，是將蛋白貨物整合到膜結合的細胞器或結構中進行分泌的途徑[21]。分泌形式包括微囊泡、外泌體、分泌型自噬和分泌型溶酶體等。

2.3.1 微囊泡形式分泌 微囊泡（microvesicles，MVs）是質膜向外收縮時直接從質膜上脫落的囊泡，含有非常規分泌的物質。微囊泡是細胞外小泡（extracellular vesicles，EVs）的一部分，直徑在50 nm～1000 nm[22]。

Jeppesen等[23]用結構照明顯微鏡(SIM)觀察到，膜聯蛋白A1在質膜上染色較深，可直接在質膜上觀察到膜聯蛋白 A1陽性囊泡的萌發；膜聯蛋白A1陽性囊泡的大小分布在150 nm~1000 nm之間，與經典的微囊泡大小一致，其生物發生需要從質膜上脫落，這使膜聯蛋白A1成為經典微囊泡的特異性分子標記。

2.3.2 外泌體 1983年，Pan和Johnstone[24]發現外泌體（exosome），它是細胞內多泡體(multivesicular body，MVB)與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中的膜性囊泡，是一種直徑為40 nm~100 nm的納米級脂質包裹體結構，內部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物質[25]。幾乎所有類型的細胞都可以產生并釋放外泌體。

在細胞質中，膜聯蛋白在膜轉運和內吞作用中起重要作用。有研究表明，外泌體在膜聯蛋白的分泌中發揮了作用。Leoni等[27]發現，內源性膜聯蛋白A1定位于細胞外小泡（EV），通過免疫金標記法和電子顯微鏡觀察到膜聯蛋白A1存在于與外泌體大小和形狀一致的小泡中。CD63已被報道為外泌體的一種成分，采用超速離心和瓊脂糖珠親和純化的方法分離外泌體，通過免疫印跡法檢測，在含有CD63的EVs中發現了膜聯蛋白A1[26]。Pessolano等[28]利用Western印跡分析也發現膜聯蛋白A1存在于細胞外泌體中，且可以通過內吞和胞吐途徑與質膜融合。Maji等[29]通過免疫電子顯微鏡分析表明，膜聯蛋白A2主要存在于外泌體的表面和管腔。Valapala等[30]研究發現，膜聯蛋白A2是受離子載體刺激后細胞釋放的外泌體的組成部分，在這個研究中，利用免疫印跡法證實了外泌體中含有膜聯蛋白A2，且經過離子載體處理后，在外泌體標記蛋白hsc70的水平增加的同時，膜聯蛋白A2的水平也增加。外泌體抑制劑DMA可以抑制干擾素-?刺激增加肺上皮細胞膜聯蛋白A2的細胞表面易位[31]。研究表明，膜聯蛋白A5可以作為外泌體的標記蛋白[32]。Comfort等[33]利用毛細管免疫分析方法對細胞外泌體進行蛋白質定量，發現了膜聯蛋白A5的存在。Raj等[34]對超速離心得到的外泌體蛋白進行iTRAQ分析也發現了膜聯蛋白A5的存在。Sakwe等[35]通過免疫印跡對分泌的提取物和細胞總蛋白進行分析表明，膜聯蛋白A6由乳腺癌細胞以鈣離子依賴的方式通過外泌體分泌。綜上所述，膜聯蛋白可以通過外泌體分泌。

2.3.3 分泌型自噬 自噬是一種利用溶酶體降解失活蛋白質和細胞器的穩態過程。有研究表明，自噬可以不涉及STX17及其復合體，由幾種與囊泡運輸和融合有關的蛋白質，如Rab蛋白(Rab8A)和SNARES蛋白(SEC22B)，通過避免經典的自噬體-溶酶體融合來介導分泌型自噬，并驅動自噬體與細胞膜融合。自噬體也可以與MVB融合，形成amphisomes，將貨物運輸到膜外。

雖然自噬和囊泡運輸之間的關系仍不清楚，但已知Rab蛋白參與了這兩個過程，例如，Rab7和Rab11A在自噬途徑和EV運輸中都起作用[36]。在干擾素-?的刺激下，自噬小體可與MVB融合，將膜聯蛋白A2運輸到外泌體。在這個途徑中，膜聯蛋白A2被運輸到自噬小體中，自噬小體以Rab11依賴的方式與MVB融合后，以Rab8A和Rab27A依賴的方式與質膜融合。在同一項研究中，自噬相關蛋白也被證明在膜聯蛋白A2感染外泌體的分泌中發揮作用，如當自噬蛋白5(ATG5)被敲低時，外泌體中的膜聯蛋白A2分泌減少[37]。綜上所述，干擾素-?刺激可以誘導分泌型自噬增加細胞表面膜聯蛋白A2的數量。

2.3.4 分泌型溶酶體 分泌型溶酶體是一類能夠對外界刺激進行調節分泌的溶酶體。有研究表明，前列腺體是通過分泌型溶酶體與質膜融合釋放到膜外的。前列腺體是由前列腺上皮細胞分泌的小泡，其中包括了膜聯蛋白A2[38]。由于沒有相關證據表明阻斷分泌型溶酶體途徑后，膜聯蛋白A2的分泌是否會發生變化，所以，尚不確定膜聯蛋白A2單蛋白是否可以通過分泌型溶酶體途徑運輸到膜外。

3 結語

自1978年Creutz等人發現膜聯蛋白以來，到現在已經將近50年了，其功能也被大家逐漸發現，然而，作為一種非常規分泌蛋白，膜聯蛋白的分泌模式尚未被完全認知。雖然已經了解了幾種膜聯蛋白A家族的非常規分泌機制，包括直接跨質膜運輸、通過細胞外囊泡運輸以及通過分泌型自噬體等途徑，但仍有些問題亟待解決，如哪些刺激可以促進或抑制膜聯蛋白的分泌，膜聯蛋白直接跨質膜運輸是否需要特定的環境，在沒有干擾素-?刺激的情況下，膜聯蛋白A2還能否通過分泌型自噬途徑分泌等。這些問題的解決將有助于更好地了解膜聯蛋白家族的分泌機制，對相關疾病的治療也將具有重要的現實意義和價值。